不同年齡階段家兔髂軟骨組織學特點

荊立忠 郭秦煒 胡躍林

北京大學第三醫(yī)院運動醫(yī)學研究所（北京100191）

修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損尤其是重度缺損始終是臨床醫(yī)師面對的棘手難題。其主要手術(shù)方法包括鉆孔術(shù)、微骨折術(shù)、自體骨軟骨移植術(shù)以及軟骨細胞移植術(shù)等[1-3]。但每種術(shù)式均有缺點:鉆孔術(shù)及微骨折術(shù)不適用于大面積的軟骨缺損和嚴重的骨軟骨損傷；骨軟骨移植術(shù)容易造成供區(qū)關(guān)節(jié)軟骨損傷從而影響供區(qū)關(guān)節(jié)功能；軟骨細胞移植術(shù)費用昂貴且需行二次手術(shù)等[4]。近年來，一些學者將髂軟骨作為軟骨修復(fù)的組織來源[5，6]，從而克服了上述各種術(shù)式的缺點。但髂軟骨的性質(zhì)及隨年齡增長的變化特點，目前缺乏相關(guān)的詳細研究。本實驗觀察了不同年齡階段家兔髂軟骨的組織學特征，并與相應(yīng)年齡階段的膝關(guān)節(jié)軟骨進行比較，研究其與關(guān)節(jié)軟骨在組織結(jié)構(gòu)方面的異同點。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康新西蘭大白兔15只，1月齡、3月齡、4月齡、6月齡、12月齡各3只。雌雄不限。

1.2 標本的處理

分別用骨刀切取每只家兔的兩側(cè)髂軟骨及少量軟骨下骨和1月齡、3月齡和12月齡組膝關(guān)節(jié)股骨滑車軟骨標本各1塊，直徑4 mm、厚度6 mm，將標本修切整齊，用于組織學分析:取材后馬上浸入4%多聚甲醛（solarbio公司）固定48小時，生理鹽水沖洗，然后放入10%甲酸脫鈣液脫鈣7～10天，石蠟包埋后切片，厚度5 mm。

1.3 組織化學染色

分別將各組髂軟骨和關(guān)節(jié)軟骨的切片脫蠟，進行HE染色和甲苯胺藍染色。

1.4 免疫組化染色

小鼠抗兔I型膠原單克隆抗體、小鼠抗兔II型膠原多克隆抗體均購自Calbiochem公司。山羊抗小鼠第二抗體（PV-6002）及胃蛋白酶均購自中杉金橋公司，DAB顯色試劑盒購自基因科技公司。

分別將各年齡段髂軟骨和關(guān)節(jié)軟骨的切片脫蠟，恢復(fù)室溫后，用胃蛋白酶處理（37℃，30分鐘），然后分別滴加抗I型及II型第一抗體 （濃度均為1:200，37℃，2小時）。 DAB法顯色，陽性結(jié)果為棕色。各組均用PBS代替第一抗體作為免疫組化染色陰性對照。

1.5 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用Image-Pro PLUS醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)對軟骨標本進行成像，分別測量軟骨厚度（μm）及細胞密度（個/10000μm2）。 采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，兩組之間采用t檢驗，多組之間采用單因素方差分析檢驗進行比較。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，P<0.05表示差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 關(guān)節(jié)軟骨的組織學染色

關(guān)節(jié)軟骨主要由透明軟骨細胞組成。隨著年齡的增長，軟骨細胞密度逐漸下降，軟骨層厚度逐漸變薄，肥大層及鈣化層逐步出現(xiàn)細胞骨化。甲苯胺藍染色變淺。II型膠原免疫組化染色陽性（圖1）。按表層、移行層、柱狀層、肥大層、鈣化層分層后對每層厚度及細胞密度進行測量，具體數(shù)據(jù)見表1。

圖1 各年齡組關(guān)節(jié)軟骨組織學染色結(jié)果（×40）

表1 關(guān)節(jié)軟骨厚度及細胞密度隨年齡增長的變化

2.2 髂軟骨的組織學染色結(jié)果

2.2.1 1月齡標本

HE染色可見，淺表層及中間層有大量軟骨細胞，形態(tài)主要為圓形，體積較小，軟骨細胞分布均勻，內(nèi)無細胞肥大及鈣化現(xiàn)象；深層軟骨細胞呈扁平型，細胞長徑垂直于骨之長軸，同源細胞群呈長串狀，與髂骨縱軸平行排列；鈣化軟骨層較窄，細胞體積增大，胞質(zhì)呈空泡狀。甲苯胺藍染色均勻，無失染現(xiàn)象。II型膠原免疫組化染色陽性，I型膠原免疫組化染色陰性。

2.2.2 3月齡標本

HE染色可見，淺表層及中間層變薄，部分區(qū)域出現(xiàn)肥大軟骨細胞，大而圓，三五成群；深層長串狀的同源細胞群相對變少。肥大軟骨細胞區(qū)甲苯胺藍染色缺失。肥大軟骨細胞區(qū)II型膠原免疫組化染色陰性，其余區(qū)域染色陽性。軟骨區(qū)I型膠原免疫組化染色陰性，軟骨下骨I型膠原免疫組化染色陽性。

2.2.3 4月齡標本

圖2 各年齡組髂軟骨組織學染色結(jié)果（×40）

HE染色可見，淺表層及中間層部分區(qū)域出現(xiàn)散在骨化灶；深層長串狀的同源細胞群變少。骨化區(qū)甲苯胺藍染色缺失。骨化區(qū)II型膠原免疫組化染色陰性，其余軟骨區(qū)域染色陽性。軟骨區(qū)I型膠原免疫組化染色陰性，骨化區(qū)及軟骨下骨I型膠原免疫組化染色陽性。

2.2.4 6月齡標本

HE染色可見，淺表層及中間層軟骨幾乎全部骨化，軟骨細胞稀少；深層長串狀的同源細胞群變短、變稀，細胞數(shù)量進一步減少；鈣化軟骨層部分細胞出現(xiàn)骨化，細胞數(shù)量減少。骨化區(qū)甲苯胺藍染色缺失。骨化區(qū)II型膠原免疫組化染色陰性，其余區(qū)域染色陽性。軟骨區(qū)I型膠原免疫組化染色陰性，骨化區(qū)及軟骨下骨I型膠原免疫組化染色陽性。

2.2.5 12月齡標本

HE染色見軟骨層缺失，軟骨幾乎全部骨化；甲苯胺藍染色淺染，II型膠原免疫組化染色弱陽性，染色區(qū)域窄，I型膠原免疫組化染色陽性。

3 討論

髂軟骨是肌腱在髂骨處的附著點，屬于特殊類型的牽拉性軟骨[7]，其骨化后表面即成為肌腱止點。作為肌肉附著于骨面的著力點，肌腱止點不僅要把肌肉的收縮力量完全傳遞到效應(yīng)骨上，還要有應(yīng)力緩沖作用[8]，這就可以理解髂軟骨存在的意義。

Ponseti等[7]通過 HE組織學染色初步研究、比較了人體髂軟骨在組織形態(tài)學及化學成分上的異同，研究集中在兒童到青少年階段，作者研究發(fā)現(xiàn)嬰幼兒的髂軟骨主要由透明軟骨組成。青年期開始出現(xiàn)軟骨細胞肥大、骨化現(xiàn)象。該實驗欠缺之處在于作者未進一步對比成年標本，也未深入全面地將其與關(guān)節(jié)軟骨加以對比。此后，利用髂軟骨修復(fù)各種關(guān)節(jié)軟骨缺損屢見報道[5，6]，髂軟骨也廣泛應(yīng)用于修復(fù)多種顏面部缺損畸形[9]，均取得較滿意的結(jié)果。但髂軟骨的性質(zhì)以及隨年齡增長出現(xiàn)的變化，相關(guān)學者并未繼續(xù)進行深入研究。

本研究中，關(guān)節(jié)軟骨的組織學特點及其隨年齡出現(xiàn)的變化規(guī)律與其他有關(guān)學者的研究[10]一致:隨著年齡增長，軟骨細胞密度逐漸下降，細胞體積增大，軟骨層厚度逐漸變薄。本實驗進一步按表層、移行層、柱狀層、肥大層、鈣化層對每層厚度及每層軟骨細胞密度隨年齡增長出現(xiàn)的變化進行了描述，從而更加全面地闡述了其變化規(guī)律。另外，隨著年齡增長，甲苯胺藍染色也稍微變淺，這可能與基質(zhì)合成能力下降有關(guān)。肥大層及鈣化層出現(xiàn)鈣化，但正常條件下表層、移行層、柱狀層無軟骨鈣化。

與關(guān)節(jié)軟骨類似，髂軟骨也主要由透明軟骨細胞組成，基本可劃分為淺表層、中間層、深層以及鈣化層。但與關(guān)節(jié)軟骨不同的是，隨著年齡的增長出現(xiàn)軟骨細胞肥大及骨化現(xiàn)象的主要為淺表層及中間層，首先是淺表層及中間層不同部位出現(xiàn)數(shù)個小的骨化灶，至成年期骨化灶連成一個整體，最終整個軟骨層幾乎全部骨化。由幼年到成年，甲苯胺藍染色以及II型膠原免疫組織化學染色均逐漸變淺；I型膠原免疫組織化學染色顯示其只在軟骨下骨及肌腱部位著色，成年后隨著軟骨出現(xiàn)骨化，I型膠原在骨化區(qū)著色。如實驗所述，成年后各透明軟骨相關(guān)指標雖然都有所下降，但仍有II型膠原蛋白的合成及蛋白粘多糖、硫酸軟骨素的分泌，而這些指標正是透明軟骨所特有的。

與髂軟骨類似，髕尖末端結(jié)構(gòu)也屬于牽拉性軟骨的一種。丁長隆等[8]在對其進行研究時發(fā)現(xiàn)在有些老年髕尖末端結(jié)構(gòu)內(nèi)，部分老化纖維軟骨細胞反分化為透明軟骨細胞形成透明軟骨島，原有的纖維軟骨細胞幾乎不可見。關(guān)于其發(fā)生原因，作者推測可能為各種因素致使局部細胞環(huán)境發(fā)生改變，刺激老化細胞發(fā)生反分化，再由這種分化較低的細胞分化成透明軟骨島。近年來大量實驗已證實，多種細胞生長因子均能使肥大骨化的軟骨細胞出現(xiàn)反分化[11，12]，我們推測，上述細胞出現(xiàn)反分化的原因可能與局部生長因子的作用有關(guān)。如果推測成立，生長因子對同為牽拉性軟骨的髂軟骨有無類似作用將值得進一步探討。

總之，髂軟骨有希望成為軟骨缺損的修復(fù)材料，結(jié)合其具有手術(shù)操作簡單、來源充足、無關(guān)節(jié)供區(qū)損傷等優(yōu)點，對其進行全面深入研究將為軟骨缺損修復(fù)領(lǐng)域開辟新思路，進而有助于解決大面積關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)的難題。但移植到軟骨缺損區(qū)后會不會發(fā)生骨化以及如何克服此種弊端，尚需進一步研究證實。

4 總結(jié)

家兔幼年期髂軟骨類似于關(guān)節(jié)透明軟骨，但隨著年齡的增長，髂軟骨細胞逐漸肥大、骨化，至成年期仍有少量透明軟骨細胞特有的II型膠原蛋白及蛋白多糖的合成。

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