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    模擬胃環(huán)境中絲素蛋白復(fù)合材料的溶蝕機制

    2012-11-16 11:31:46陳忠敏張艷冬胡仁建
    絲綢 2012年4期
    關(guān)鍵詞:絲素聚乙烯醇胃液

    陳忠敏,張艷冬,羅 琴,胡仁建

    (重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院,重慶 400054)

    模擬胃環(huán)境中絲素蛋白復(fù)合材料的溶蝕機制

    陳忠敏,張艷冬,羅 琴,胡仁建

    (重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院,重慶 400054)

    以聚乙二醇為增塑劑,通過水相共混法制備了不同比例的絲素蛋白/聚乙烯醇/聚乙二醇復(fù)合材料。利用紅外光譜對復(fù)合材料進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征,并通過失重試驗、紅外光譜(FTIR)、X-射線衍射(XRD)、掃描電鏡(SEM)對復(fù)合材料在模擬胃環(huán)境中的溶蝕機制進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,絲素蛋白/聚乙烯醇/聚乙二醇復(fù)合材料的溶蝕降解首先從絲素蛋白的溶出、分解,并形成細(xì)微孔道開始,然后胃液通過細(xì)微孔道逐步深入并溶蝕聚乙二醇和聚乙烯醇。該絲素蛋白/聚乙烯醇/聚乙二醇復(fù)合材料具有潛在的藥物緩釋應(yīng)用前景。

    絲素蛋白;聚乙烯醇;聚乙二醇;藥物緩釋材料;溶蝕機制

    藥物緩釋給藥與傳統(tǒng)給藥相比,可以減少給藥次數(shù)、維持血液中藥物的濃度,以解決藥物濃度不穩(wěn)定的問題,提高藥物療效,降低藥物毒副作用,減輕病人多次用藥的痛苦,提高病人的用藥依從性,對于提高臨床用藥水平具有重大意義,成為近年來國內(nèi)外新藥物制劑領(lǐng)域的研發(fā)熱點之一[1]。藥物緩釋系統(tǒng)中的藥物載體通常有兩類,即合成高分子載體和天然高分子載體。合成高分子載體存在著生物相容性差、不易降解的缺點,其應(yīng)用范圍受限。天然高分子載體因具有優(yōu)良的生物降解溶蝕性、生物相容性等而成為藥物緩釋載體研究領(lǐng)域的熱點之一。

    再生蠶絲素蛋白(SF)是一種纖維狀蛋白質(zhì)材料,對人體無毒副作用、免疫原性,具有良好的生物相容性和生物降解性[2],可加工成各種形狀,具有成為理想的藥用緩釋載體材料的應(yīng)用潛力。研究發(fā)現(xiàn),SF在一般水中幾乎無溶解性,但在存在著各種活性蛋白酶的胃液等中時卻能快速溶解并水解,存在著降解性能和速率、降解產(chǎn)物不可控的缺點。國內(nèi)外研究中有篩選合適的固化工藝來提高絲素的結(jié)晶區(qū)比例法,以及通過復(fù)合材料性能互補的原理,將絲素與其他高分子接枝或混合法來改造其溶蝕降解性能。其中,分別利用聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)對絲素蛋白修飾改造的研究有不少報道[3-7]。PVA具有無毒、親水性高、成膜性好、生物相容性好及力學(xué)性能良好等特性,且可生物降解。PEG具有中性、無毒、良好的生物相容性和血液相容性,且是迄今為止已知的蛋白質(zhì)聚合物中蛋白和細(xì)胞吸收水平最低的聚合物。但這些化合物的修飾也只是讓絲素蛋白減緩了溶蝕降解的速度,卻不能達(dá)到逐步遞次溶蝕降解從而緩釋藥物的目的。在對SF、PVA、PEG結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究的基礎(chǔ)上,本研究選用SF與PVA、PEG依次共混制備法,制備出了不同配比的SF/PVA/PEG復(fù)合材料,重點考察了材料在模擬胃液中的溶蝕現(xiàn)象、溶蝕過程變化,從而為緩釋藥物提供條件。

    1 試 驗

    1.1 材 料

    廢棄繭殼(西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院);碳酸鈉、乙醚、無水氯化鈣、乙醇(市售,分析純);聚乙烯醇1799、聚乙二醇400(進(jìn)口分裝);胃蛋白酶(Sigma公司分裝);中性蛋白酶(國藥集團(tuán)南寧化學(xué)試劑有限公司);透析袋(進(jìn)口分裝),標(biāo)定截留相對分子質(zhì)量為14 000,使用前按使用說明在2 %碳酸氫鈉和l mmol/L EDTA(pH8.0)中煮沸10 min,并用蒸餾水洗凈。

    1.2 SF粉末的制備

    將繭殼用乙醚浸泡48 h除去蠟質(zhì),用蒸餾水洗凈,干燥后用無水乙醇在室溫下浸泡24 h除去部分有機物和雜質(zhì),洗凈、干燥。用0.5 %的Na2CO3將干凈繭殼煮沸30 min,3次,用蒸餾水洗滌干燥得到纖維狀絲素蛋白。用苦味酸胭脂紅溶液檢驗絲膠脫除情況。

    將絲素纖維溶解在CaC12/C2H5OH/H2O(摩爾比1︰2︰8)的有機無機混合溶劑中,將溶解液裝入標(biāo)定截留相對分子質(zhì)量為14 000的透析袋內(nèi)透析3 d,取出,使用中性蛋白酶進(jìn)行酶解,酶解條件為:pH6.0~7.0,溫度50~55 ℃。酶解完成后放入-40 ℃超低溫5~10 min使酶失活。用超濾膜過濾并用雙蒸水多次沖洗后,以冷凍干燥法得到SF粉末。

    1.3 SF/PVA/PEG復(fù)合材料的制備

    稱取PVA 2 g,在95 ℃水浴加熱至完全溶解,按照文獻(xiàn)[8]中得到的SF/PVA最佳配比(質(zhì)量比30/70)加入SF粉末,攪拌20 min。取混合溶液按照(SF+PVA)/PEG質(zhì)量比分別為90︰10、80︰20、70︰30加入PEG,繼續(xù)攪拌5 h,濃縮使其總質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到約10 %,得到SF/PVA/PEG共混液。

    取5 mL共混液放入自制成膜裝置中,室溫放置6 h后再放入烘箱,在50 ℃條件下干燥4 h,之后再放置在室溫條件下平衡10 h,得到膜片狀材料樣品。將制得的樣品放入干凈樣品袋密封保存、待用。

    1.4 SF/PVA/PEG材料溶蝕試驗

    將上述制備的不同配比的SF/PVA/PEG材料裁剪成長×寬×厚=10 mm×10 mm×30 μm的薄片,干燥12 h后取出稱重w,再將膜片放入溫度恒定在(37±1)℃、200 mL的模擬胃液中[模擬胃液按照2010藥典(附錄)配制],20 r/min下攪拌。分別在1、2、3、4 h取出膜片,沖洗干凈后干燥稱重為w1。根據(jù)下式計算失重率:

    同時分別將在人工胃液中溶蝕了1、2、3、4 h的各薄膜片樣品取出進(jìn)行儀器表征。

    1.5 表 征

    分析天平(SL202N上海明橋精密科學(xué)儀器有限公司)用于失重分析測試。傅立葉變換紅外光譜儀(Perkin Elmer Sectrum 100)用于復(fù)合材料結(jié)構(gòu)表征及對在人工胃液中溶蝕前后取出的膜材料結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化進(jìn)行表征,采用KBr壓片法進(jìn)行。掃描電子顯微鏡(LEO-supra35 德國ZEISS公司生產(chǎn))用于在人工胃液中溶蝕前后取出的膜材料進(jìn)行表面結(jié)構(gòu)觀察。X-射線衍射(D/max 2500X射線衍射儀,日本理學(xué)公司)用于在人工胃液中溶蝕前后取出的膜材料進(jìn)行結(jié)晶變化考察。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 SF/PVA/PEG復(fù)合材料紅外表征

    圖1所示為SF、PVA、SF/PVA及SF/PVA/PEG材料的紅外光譜特征峰值。從圖1可以看出,SF/PVA 材料中出現(xiàn)了2種高分子的特征吸收峰,為3 264 cm-1(ν,O-H,吸收峰寬而鈍),1 662 cm-1(νC=O,酰胺Ⅰ),1 538 cm-1(δN-H,酰胺Ⅱ),1 406 cm-1(δC-H2)等,說明兩者已混合。而在添加了PEG成為SF/PVA/PEG材料后,除了屬于(ν, C-H)的吸收峰2 917 cm-1往低波數(shù)方向移動以外,其余各吸收峰與SF/PVA材料吸收峰相比較,均向高波數(shù)方向發(fā)生了移動。紅外光譜圖確認(rèn)了SF/PVA/PEG復(fù)合材料,同時顯示了SF和PVA的結(jié)合可能是通過基團(tuán)分子間作用力,如氫鍵等的相互作用而結(jié)合,SF的分子構(gòu)象發(fā)生了變化,在添加了較為微量的PEG后,材料中SF的分子構(gòu)象進(jìn)一步發(fā)生了改變,其羥基的吸收峰幅變寬。

    圖1 SF/PVA/PEG不同比例復(fù)合材料紅外光譜Fig.1 FTIR spectra of composite materials consisting of different ratios of SF, PVA and PEG

    2.2 模擬胃液中的溶蝕研究

    2.2.1 溶蝕失重試驗結(jié)果

    SF/PVA/PEG材料是以其作為緩控釋藥用載體材料應(yīng)用目標(biāo)而設(shè)計的,所以對該材料進(jìn)行了體外溶蝕性能測試,測試采用了模擬胃液。圖2為SF/PVA/PEG復(fù)合材料在模擬胃液中的溶蝕失重曲線。試驗中純SF不能成膜,其粉末狀物質(zhì)在放入人工胃液后大約2 min就完全溶解,確認(rèn)了SF在有蛋白酶存在的胃液環(huán)境中的快速溶解性。圖2顯示了純PVA膜、SF/PVA和不同配比的SF/PVA/PEG膜材料隨時間溶蝕的失重曲線。

    圖2 SF/PVA/PEG不同比例復(fù)合材料溶蝕失重曲線Fig.2 Weight loss curves of composite materials consisting of different ratios of SF, PVA and PEG

    由圖2可知,各種材料在1 h內(nèi)發(fā)生了較大幅度的溶蝕,到4 h時失重的增幅不大,這可能是其中的PVA和PEG具有較大的溶蝕抵抗所致。圖2d顯示純PVA膜在模擬胃液中的溶蝕4 h失重率為22.7 %,但SF/PVA(30︰70)復(fù)合材料4 h失重率增大到了46.2 %(圖2c),由于SF的添加量占30 %,如果30 %的SF完全溶失,PVA部分的失重也僅為16.2 %,這可能是由于SF和PVA之間是通過氫鍵而結(jié)合,使得PVA的一些親水性基團(tuán)被卷入分子線團(tuán)內(nèi)部,減少了和人工胃液中的強酸性液體及蛋白酶接觸所致。在SF/PVA比例仍為30︰70,再加入10 %的PEG,即(SF+PVA)/PEG配比為90︰10的復(fù)合材料中,4 h失重率為55.2 %(圖2b);(SF+PVA)/PEG配比為70︰30的復(fù)合材料4 h失重率達(dá)到了65.5 %(圖2a),說明在加入PEG后,PEG介入了SF與PVA間的結(jié)合中,PEG自身帶有很多羥基,使整個復(fù)合材料的羥基數(shù)量增大較多,在一定程度上提高了復(fù)合材料與胃液的接觸,增大了溶蝕速度。PEG含量越高則材料的溶蝕速度越快。這與紅外光譜結(jié)果一致,說明通過調(diào)節(jié)SF、PEG在整個復(fù)合材料系統(tǒng)中的含量,可以調(diào)節(jié)材料的溶蝕釋藥性。

    2.2.2 溶蝕機理研究

    考察SF/PVA/PEG復(fù)合材料溶蝕前后材料表面、基團(tuán)構(gòu)象、結(jié)晶性等的變化,對該復(fù)合材料在模擬胃液中的溶蝕機理進(jìn)行了研究。

    圖3所示(SF+PVA)/PEG各組分比例為90︰10(其中SF/PVA為30︰70)的共混材料的人工胃液溶蝕前后的SEM圖片。圖3a為溶蝕前形貌,可見表面光滑的膜片上均勻鑲嵌著很多顆?;蚓€段,認(rèn)為是SF片段;溶蝕1 h后,片段的數(shù)量有了明顯減少(圖3b);溶蝕4 h后,SF片段基本消失,膜片呈現(xiàn)出平整光滑狀態(tài),膜片變薄(圖3c)。這可能是SF/PVA/PEG復(fù)合材料的溶蝕首先通過SF片段的溶出、分解而進(jìn)行的。對照失重曲線結(jié)論,4 h后PVA和PEG也應(yīng)有部分溶蝕,即表面溶蝕導(dǎo)致了膜片變得薄且光滑。

    圖4所示為(SF+PVA)/PEG配比為90︰10的膜材料溶蝕前后紅外光譜圖。圖4a中觀察到1 651 cm-1(νC=O,酰胺Ⅰ),1 543 cm-1(δN-H,酰胺Ⅱ), 1 243 cm-1(δ, 酰胺Ⅲ)處SF的特征吸收峰和3 279cm-1(ν,O-H),2 917 cm-1(ν,C-H),1 419 cm-1(δC-H2),1 142 cm-1(δC-H)處PVA、PEG的特征吸收峰。圖4b中SF的特征吸收峰1 651 cm-1(νC=O,酰胺Ⅰ),1 543 cm-1(δN-H,酰胺Ⅱ),1 238 cm-1(δ,酰胺Ⅲ)較a減弱,而PVA、PEG的特征吸收峰變化不明顯,圖4c、d、e中SF的特征吸收峰逐漸減弱,而屬于PVA、PEG的特征吸收峰中位于3 500~3 200 cm-1處的-OH吸收峰略有變寬,可能是分子間結(jié)合所致。這表明復(fù)合材料是通過SF首先溶出溶蝕,然后PVA、PEG間相互有分子間結(jié)合,與此同時還在逐步緩慢溶出。這和SEM觀察結(jié)果一致。

    圖4 ((SF+PVA)︰PEG=90︰10)膜溶蝕前后紅外光譜圖Fig.4 FTIR spectra of composite materials ((SF+PVA)︰PEG=90︰10)before and after being erode

    圖5所示為(SF+PVA)/PEG(90︰10)膜材料溶蝕前后X-射線衍射圖譜。從圖5可以看出,未溶蝕的SF/PVA/PEG復(fù)合材料是一個SF和PVA重疊的寬衍射峰,溶蝕后的復(fù)合材料的衍射峰逐漸尖銳化,到溶蝕4 h后衍射峰更加尖銳、清楚。這可能是復(fù)合材料的非晶區(qū)在溶蝕過程中首先被降解,使得溶蝕后的材料晶區(qū)比例增加,推測膜材料成分中首先被溶蝕的是SF和PVA的非晶區(qū)域。隨著溶蝕的進(jìn)行,材料呈現(xiàn)出結(jié)晶部分增強的趨勢,將逐漸變得易碎。

    作為一種藥物緩釋載體材料,其溶蝕過程直接控制了藥物的釋放。通過對材料溶蝕機制的分析可以初步推測出材料負(fù)載藥物時的釋藥機制,從SEM觀察的材料表面形貌變化、紅外光譜分析的基團(tuán)構(gòu)象變化和X-射線圖譜結(jié)晶變化分析結(jié)果可看出,SP/PVA/PEG材料的釋藥機制是通過SP首先溶出降解,形成細(xì)微孔道,此時可釋藥;而后隨著PVA非晶區(qū)降解,以及PEG羥基結(jié)合外界水分、酶等形成溶蝕降解,使材料釋藥孔隙再次增大,此時藥物可繼續(xù)釋放;隨著材料結(jié)晶區(qū)區(qū)域緩慢溶蝕降解,藥物釋放也隨之緩慢進(jìn)行至全部溶出。

    圖5 ((SF+PVA)︰PEG=90︰10)膜溶蝕前后X-射線衍射圖譜Fig.5 XRD curves of composite materials ((SF+PVA)︰PEG=90︰10)before and after being eroded

    3 結(jié) 語

    采用水相共混的方法制備的SF/PVA/PEG復(fù)合材料,IR表征分析認(rèn)為PEG的加入增強了SF和PVA分子間相互結(jié)合。采用模擬胃液降解的方法探討SF/PVA/PEG復(fù)合材料的溶蝕現(xiàn)象和過程,結(jié)果表明,材料的溶蝕是通過SF溶出,形成細(xì)微孔道,而后隨著溶蝕時間延長PEG再緩慢溶出,同時逐步溶蝕PVA完成。以其溶蝕機制可推測釋藥機制,SF/PVA/PEG復(fù)合材料具備應(yīng)用于緩釋藥物載體的前景。

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    Dissolution mechanism of composite materials consisting of SF, PVA and PEG in the simulated gastric juice

    CHEN Zhong-min, ZHANG Yan-dong, LUO qin, HU Ren-jian
    (College of Pharmacy and Bioengineering, Chongqing University of Technology, Chongqing 400054, China)

    The composite materials consist of different ratios of silk fibroin (SF), polyvinyl alcohol (PVA) and polyethylene glycol (PEG) which were prepared through the water phase blending method with polyethylene glycol as the plasticizer. The transformation of the composite materials before and after dissolution were investigated by the weight loss test, FTIR spectroscopy, scanning electron microscopy (SEM), and X-ray diffraction (XRD).The results reveal that the composite materials dissolve beginning with the digestion,decomposition of SF and formulation of micro-pores, and then the gastric juice dissolves PEG and PVA step by step through micro-pores. The composite materials are looked forward to using in the drug control-release system.

    Silk fibroin; Polyvinyl alcohol; Polyethylene glycol; Drug control-release materials; Degradation mechanism

    TS149

    A

    1001-7003(2012)04-0001-04

    2011-12-15;

    2012-01-30

    重慶市高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計劃(2011CQ04);國家教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金資助(2006CR01)

    陳忠敏(1968- ),女,教授,主要從事醫(yī)用藥用材料研究。

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