耐熱β-半乳糖苷酶的研究進展

董藝凝，陳海琴，劉小鳴，張 灝，陳 衛(wèi)

（江南大學食品學院，江蘇無錫214122）

耐熱β-半乳糖苷酶的研究進展

董藝凝，陳海琴，劉小鳴，張 灝，陳 衛(wèi)*

（江南大學食品學院，江蘇無錫214122）

耐熱-半乳糖苷酶因其具有較高的作用溫度和良好的熱穩(wěn)定性，在乳制品生產領域展現(xiàn)出廣闊的應用前景，其理論及應用價值正逐漸成為近年來的研究熱點。從耐熱-半乳糖苷酶的來源、酶學性質、結構特征、催化機制及定向進化研究方面綜述了耐熱-半乳糖苷酶的研究進展，并對其應用及研究前景進行了展望。

耐熱-半乳糖苷酶，結構特征，催化機制，定向進化

β-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.23，俗稱乳糖酶）可催化半乳糖苷鍵（β-D-galactosyl bond）的水解。β-半乳糖苷酶在乳制品工業(yè)中有兩項主要的應用，一是水解乳中的乳糖，二是用于功能性食品中低聚半乳糖（galacto-oligosaccharides）的合成。耐熱β-半乳糖苷酶沒有嚴格的定義，它是相對于常溫微生物來源的β-半乳糖苷酶界定的，一般把最適溫度在50℃以上的β-半乳糖苷酶稱作耐熱β-半乳糖苷酶。近年來，耐熱β-半乳糖苷酶在乳制品生產中具有顯著的優(yōu)勢，并逐漸引起人們的研究興趣。本文主要綜述了耐熱β-半乳糖苷酶的研究現(xiàn)狀，以期為耐熱β-半乳糖苷酶研究發(fā)展開拓思路。

1 耐熱β-半乳糖苷酶的來源及酶學性質

耐熱β-半乳糖苷酶主要來源于一些高溫菌和中溫細菌，如耐熱嫌氣菌、棲熱菌、嗜熱菌和古細菌等。真菌中霉菌乳糖酶也具有較高作用溫度，但酵母菌中未見報道。表1列舉了幾種不同微生物來源的耐熱β-半乳糖苷酶及其酶學性質。其中，嗜熱細菌是耐熱β-半乳糖苷酶的一個重要來源，嗜熱細菌生長溫度一般在55～65℃，酶最適溫度55～70℃。如嗜熱鏈球菌[1]、嗜熱脂肪芽孢桿菌[2]等。

研究報道表明許多棲熱菌（Thermus）也能編碼熱穩(wěn)定性的β-半乳糖苷酶。1972年，Ulrich等[14]首次對棲熱菌（Thermus sp.T2）來源的耐熱β-半乳糖苷酶的酶學性質進行了表征，該酶最適作用溫度80℃，最適pH5.0；中性環(huán)境可保持良好的穩(wěn)定性，pH7.0，70℃加熱10min可保持100%酶活。1998年，Vian等[15]將Thermus sp.T2來源的耐熱β-半乳糖苷酶在大腸桿菌中進行重組表達，重組酶的耐熱性能保持良好，70℃加熱1h酶活保留率為50%。而Ohtsu等[3]從日本Atagawa溫泉中分離到一種棲熱菌（Thermus sp.A4），其耐熱β-半乳糖苷酶具有極好的熱穩(wěn)定性，可在70℃加熱20h保持酶活不受損失。Dion等[16]從Thermus thermophilus HB27中克隆并表達了一種耐熱β-半乳糖苷酶，可以催化β-D-半乳糖苷、β-D-葡萄糖苷和β-D-果糖苷衍生物水解；最適溫度88℃，中性條件下，pH7.0，80℃加熱10min可保持100%酶活。

另外，來自Caldicellulosiruptor saccharolyticus，Sterigmatomyceselviae，Thermotoga maritime以 及Thermus aquaticu的耐熱β-半乳糖苷酶的最適作用溫度均可以達到80℃以上。沃氏火球菌（Pyrococcus woesei）最適作用溫度93℃，最適pH5.4，85℃和93℃加熱4h酶活分別保留89%和85%[17-18]。礦泉古生菌中硫磺礦硫化葉菌（Sulfolobus solfataricus）也能編碼一種極耐熱的β-半乳糖苷酶，最適溫度高于90℃[19-20]。另外，熱產硫磺梭菌（Clostridium thermosulfurogenes EM1）β-半乳糖苷酶，最適pH7.0，在70℃長時間加熱酶活仍穩(wěn)定[21]。

表1 不同微生物來源的耐熱-半乳糖苷酶及其酶學性質Table 1 Thermos table β-galactosidases from different microbial sources and its enzymatic properties

2 耐熱β-半乳糖苷酶的結構特征及催化機制

2.1 耐熱β-半乳糖苷酶的結構特征

水解酶基于氨基酸序列相似性被分類為不同家族，到目前為止，共有115個糖苷水解酶家族（Glycoside Hydrolase Family）分屬于14個超家族（Super Family）GH-A-GH-N。其中，GH-A超家族由18個水解酶家族組成（1，2，5，10，17，26，30，35，39，42，50，51，53，59，72，79，86，113），β-半乳糖苷酶屬于其中GH-1，GH-2，GH-35和GH-42（http：//www.cazy.org/Glycoside-Hydrolases.html）。目前已報道的耐熱β-半乳糖苷酶多屬于糖苷水解酶42家族（GH-42）[22]。該家族所屬乳糖酶很多來源于極性微生物（如嗜熱[23]、嗜冷[4，24]、嗜鹽微生物[25]等），因此該家族的乳糖酶結構具有理論研究代表性。GH-42家族乳糖酶具有典型的TIM（Distored triosephosphate isomerase）barrel特征，即由8個重復的β折疊接α螺旋（β/α）8單元構成酶的催化結構域[26]。該水解酶家族的催化機制屬于典型的保持型催化（Retaining glycoside hydrolases），氨基酸序列長度為600～700aa，分子量均在70～80ku之間。這一家族中每個成員都具有兩個保守的谷氨酸作為催化氨基酸。催化中心通常位于TIM barrel的第4和第7個β片層結構上，因此GH-42基于結構域特征被分類為4/7超家族（4/7 Super Family）[27]。

2.2 耐熱β-半乳糖苷酶的催化機制

糖苷水解酶有兩種經(jīng)典的催化機制，即保持型（retaining）機制和反轉型（inverting）機制，由Koshland在56年前提出并一直沿用至今。這一理論主要基于糖苷水解酶在催化過程中會出現(xiàn)兩種不同的立體化學產物，即產物的異頭碳構象與供體底物的相同或不同。水解酶家族的結構特征并不直接決定酶的立體化學催化活性，很多超家族中都同時具有保持型和反轉型糖苷水解酶。但分屬同一家族中的酶往往具有相同的催化機制。其中，耐熱β-半乳糖苷酶所屬的GH-42家族中已報道的糖苷水解酶均屬保持型。

保持型水解酶遵循兩步反應的雙替換機制（twostep double-displacement mechanism），包括糖苷-酶復合物過渡態(tài)的形成和水解，每步反應均通過酸堿催化完成[28]。這個過程需要兩個含羧基的關鍵氨基酸參與，一個作為親核基團攻擊底物異頭碳形成糖苷-酶復合物；另一個羧基基團作為酸堿催化劑，在第一步反應中使羰基氧質子化，第二步反應中催化脫去一分子水。在兩個催化關鍵殘基之間需達到一個較小的距離（0.55nm），以滿足親核攻擊反應發(fā)生的條件。

3 耐熱β-半乳糖苷酶的定向進化研究

已有的研究表明，GH-42家族β-半乳糖苷酶對乳糖的水解活性大多很弱或是缺失。究其原因為，耐熱β-半乳糖苷酶所屬微生物多生長在營養(yǎng)貧瘠的環(huán)境中，如溫泉[3，15，29]、土壤（Bacillus，Streptomyces spp.）及高鹽環(huán)境[25，30]等，據(jù)此推測進化過程中耐熱的β-半乳糖苷酶類利用乳糖并以乳糖作為主要碳源的機會很少，因而乳糖不是這類β-半乳糖苷酶的最適作用底物，故多數(shù)耐熱β-半乳糖苷酶表現(xiàn)出水解活性弱的特點[31]。目前針對耐熱β-半乳糖苷酶功能的改造主要集中在提高其乳糖水解率和低聚半乳糖（galactooligosaccharides）的合成量。這兩個生產領域分別應用到了耐熱β-半乳糖苷酶的水解催化活性和轉糖苷活性，二者有著緊密聯(lián)系，糖苷鍵在乳糖酶的催化作用下斷裂后，當糖苷受體為水分子時催化結果即表現(xiàn)為糖苷鍵的水解；與之對應，當糖苷受體為另一糖分子時則表現(xiàn)為糖苷的轉移。2010年Yeong-Su Kim等[32]從降低水解產物對乳糖酶抑制作用角度對C. saccharolyticus來源的耐熱β-半乳糖苷酶進行改造，通過預測乳糖酶抑制劑半乳糖與酶的結合位點，并對這些位點的氨基酸進行丙氨酸替換。研究發(fā)現(xiàn)Phe-349位點是影響半乳糖對酶抑制作用的關鍵位點，并針對F349進行定點突變，得到的F349S突變體酶在含有半乳糖抑制劑反應體系中乳糖水解率高達99%。2009年，德國學者Placier等[33]采用隨機突變的方法對嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的β-半乳糖苷酶進行改造，篩選得到轉糖苷活性提高的突變體R109K。通過對Arg-109位點進行點飽和突變，成功獲得低聚半乳糖（Galacto-oligosaccharide）合成能力提高的突變體R109W。

4 展望

耐熱β-半乳糖苷酶與常溫及低溫乳糖酶類相比，其在乳品生產工藝中有著顯著的優(yōu)勢。大多數(shù)的耐熱β-半乳糖苷酶的最適作用溫度在60℃以上，高溫下熱穩(wěn)定性良好，能夠有效降低生產工藝中微生物污染的風險。同時，耐熱β-半乳糖苷酶具有較高的抗化學變性作用，在室溫下有較長的貯存期。另外，較高的作用溫度使耐熱β-半乳糖苷酶的催化反應具有較高的初始反應速率和底物溶解濃度，可以提高反應速度，降低反應體系粘度及水解產物對反應的抑制作用，有利于提高生產效率。因而，耐熱β-半乳糖苷酶多表現(xiàn)出良好的轉糖苷活性。其中來自于Alicyclobacillus acidocaldarius的耐熱β-半乳糖苷酶轉糖苷活性最高可達592U/mg[34]。圍繞耐熱β-半乳糖苷酶高溫下生產優(yōu)勢的研究報道很多，但將其應用到生產的研究還不是很多，僅有個別重組表達的耐熱β-半乳糖苷酶用于低聚乳糖生產的研究報道，包括Geobacillus stearothermophilus[33]、Pyrococcus furiosus[35]以及Thermus sp.[36]來源的耐熱β-半乳糖苷酶。雖然耐熱β-半乳糖苷酶在生產及貯存方面的優(yōu)點越來越引起人們的關注，但由于熱穩(wěn)定性的酶大都來源于嗜熱微生物，這些微生物往往難以進行大規(guī)模培養(yǎng)，或需要高溫發(fā)酵設備。利用基因工程技術構建能高效表達耐熱酶的常溫重組工程菌，可有效解決這一難題。因為常溫重組工程菌在發(fā)酵過程中產生的宿主蛋白絕大多數(shù)對熱不穩(wěn)定，只要將工程菌的發(fā)酵液進行熱處理就可方便地純化異源耐熱酶蛋白，易于大規(guī)模生產及純化。但未來還需要在耐熱β-半乳糖苷酶高效表達系統(tǒng)構建領域進行不斷的探索，這也將是實現(xiàn)耐熱β-半乳糖苷酶應用價值的一項重要課題。

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Research progress in thermostable β-galactosidases

DONG Yi-ning,CHEN Hai-qin,LIU Xiao-ming,ZHANG Hao,CHEN Wei*
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Thermostable β-galactosidases have become commercially important in the field of diary industry, owing to their high catalytic temperature and stability.Because of their significant value in theoretical research and application,thermostable β-galactosidases have

a great deal of attention.In this review,the research progress on thermostable β-galactosidases were discussed,including the sources of microorganism, characteristics,structural properties,catalytic mechanism and directed evolution of thermostable β-galactosidases. The industrial needs for thermostable-galactosidases and improvements required to their application in the future were also suggested.

thermostable β-galactosidase；structure properties；catalytic mechanism；directed evolution

TS201.2+5

A

1002-0306（2012）01-0384-04

2011－01－10 *通訊聯(lián)系人

董藝凝（1980-），女，博士研究生，研究方向：食品生物技術。

中央高校基本科研業(yè)務費專項資金（JUSRP11017，JUSRP31002）。