鱷魚肉提取物增強免疫力的實驗研究

湯四榮 周靖宇 吳松青

（廣東中大南海海洋生物技術(shù)工程中心有限公司，廣東 廣州 510330）

鱷魚，屬脊椎類兩棲爬行動物，我國古代稱為鼉龍”，是一種科研價值、生態(tài)價值、經(jīng)濟價值較高的野生動物。其藥用價值始載于《名醫(yī)別錄》：“主少氣吸吸，足不立地。”“少氣吸吸” 即指今天的咳嗽、哮喘。近十年來，隨著科技含量的提高，鱷魚的藥用價值得到了越來越廣泛的認識?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為，鱷魚肉、骨、甲及內(nèi)臟含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素和多種微量元素，能補氣、壯筋骨、驅(qū)濕邪，治哮喘，食用有提高免疫力的功效，其營養(yǎng)價值比豬、牛、羊肉都高。有關(guān)鱷魚肉相關(guān)提取物的研究偶有報道，提示鱷魚肉可能有增強免疫力的功效。通過本實驗，檢驗人工養(yǎng)殖暹羅鱷魚肉酶解液的增強免疫力的效果，對鱷魚肉的相關(guān)研究提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

受試樣品：鱷魚肉酶解液（簡稱EM），200g新鮮鱷魚肉通過蛋白酶酶解后，制成300mL鱷魚肉酶解液，自制；環(huán)磷酰胺注射粉針，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)。KM小鼠，SPF級，體質(zhì)量18～22g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。鱷魚肉酶解液按照人體用量3.6mL/天，按5倍、10倍、30倍三組劑量喂養(yǎng)小鼠。折算后低、中、高劑量分別為0.3mL/kg、0.6mL/kg、1.8mL/kg。每組10只小鼠。

1.2 實驗方法

1.2.1 遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)實驗

各組小鼠先灌胃給藥5周，正常組、未致敏組和環(huán)磷酰胺模型組小鼠灌胃給予純凈水，給藥第4周開始，除正常組和未致敏組外，其它各組小鼠均腹腔注射環(huán)磷酰胺150mg/kg，每周1次連續(xù)2周造模。喂養(yǎng)結(jié)束后，除未致敏組外，其余組用1%DNCB丙酮麻油（丙酮：麻油=1∶1）50μL涂沫在小鼠腹部（皮毛預(yù)先減去），第2天強化一次，5日后，用1%DNCB丙酮麻油10uL涂沫小鼠右耳，24h后處死，打孔器打下8mm耳片，稱重，計算左右耳片重量之差，表示DTH程度。

1.2.2 血清溶血素實驗

各組小鼠連續(xù)給藥2周，正常組給予純凈水。第10天腹腔注射2%SRBC懸液0.2mL，5天后摘眼取血，分離血清，稀釋100倍后進行溶血素測定。取稀釋的血清1mL，加入0.5mL 10% SRBC懸液、1mL 1∶8稀釋的豚鼠血清，對照管取1mL生理鹽水，加入0.5mL 10%SRBC懸液，1mL 1∶8稀釋的豚鼠血清，37℃恒溫水浴10min，冰水終止反應(yīng)，2000rpm/min離心10min，取1mL上清液，加入3mL都氏試劑，同時取10%（v/v）SRBC 0.25mL 加都氏試劑至4mL，混勻，靜置10min后，以對照管作為試劑空白，于540nm波長處比色，測定OD值。另取0.25mL 10% SRBC懸液，用都氏試劑稀釋至4mL,，搖勻放置10min后，于540nm測定SRBC半數(shù)溶血時的OD值。按下式計算樣品的半數(shù)溶血值（HC50）。

1.2.3 小鼠碳廓清實驗

實驗前各組小鼠先灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥4周，正常對照組和模型對照組小鼠灌胃給予同體積的純凈水。同時用注射用環(huán)磷酰胺150mg/kg造成小鼠的免疫抑制模型，除正常對照組外，各組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺劑量為150mg/kg，每周1次。于末次給藥30min后，尾靜脈注射已用生理鹽水稀釋10倍并經(jīng)過濾的中華墨汁0.2mL/20g，注射后2min及15min時，用預(yù)先1%肝素鈉濕潤的吸管分別從眶后靜脈叢取血20μL溶于2mL 0.1%Na2CO3溶液中搖勻，在波長A640nm下比色，測定光密度OD值。實驗結(jié)束后處死小鼠，分別稱取肝、脾、胸腺重量。按公式計算廓清指數(shù)K或校正系數(shù)α值。

注：OD1，OD2:不同時間所取血樣的光密度；t2-t1:兩取血樣的時間差。

1.2.4 對小鼠NK細胞的影響

小鼠每日灌胃給藥1次，連續(xù)給藥8周，給藥第5周開始，采用外周血NK計數(shù)。摘眼采血0.5mL于EDTA-K2抗凝管內(nèi)混勻，取50μL外周血于流式管，另取50μL外周血加于陰性流式管，設(shè)定NK1.1抗體單染管及CD3抗體單染管。各組小鼠外周血加入NK1.1抗體2.5μL及CD3抗體2μL，避光反應(yīng)15min，加入溶血素1mL，避光反應(yīng)10min，1000rpm/min離心5min，棄上清，用2mL PBS洗滌1次，振蕩，1000rpm/min離心5min，棄上清；0.5mL PBS重懸，上機。

2 實驗結(jié)果

2.1 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實驗結(jié)果

由表1可見，鱷魚肉酶解液中、高劑量組與模型組比較均有顯著性差異（P＜0.05），表明鱷魚肉酶解液的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實驗結(jié)果為陽性。

表1 受試樣品對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)結(jié)果（±sD，n=10）

表1 受試樣品對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)結(jié)果（±sD，n=10）

注：與同期模型對照組比較 * P＜0.05

組別 給藥劑量（mL/kg）腫脹度（%）正常對照組 蒸餾水 8.83±4.15*未致敏對照組 蒸餾水 1.92±0.81*環(huán)磷酰胺模型組 蒸餾水 3.36±2.05 EM低劑量 0.30 4.69±1.77 EM中劑量 0.60 5.92±1.75*EM高劑量 1.80 6.91±2.48*

2.2 對小鼠血清溶血素實驗結(jié)果

由表2可見，鱷魚肉酶解液中、高劑量組與正常組比較均有顯著性差異（P＜0.05），表明鱷魚肉酶解液血清溶血素實驗結(jié)果為陽性。

表2 受試樣品對小鼠血清溶血素結(jié)果（±sD，n=10）

表2 受試樣品對小鼠血清溶血素結(jié)果（±sD，n=10）

注：與同期正常組比較*P＜0.05

組別 給藥劑量（mL/kg）HC50正常對照組 蒸餾水 79.5±29.2 EM低劑量 0.30 110.0±33.4 EM中劑量 0.60 127.1±44.1*EM高劑量 1.80 156.4±73.5*

2.3 對小鼠碳廓清實驗結(jié)果

由表3可見，鱷魚肉酶解液三個劑量能提高吞噬指數(shù)，但與模型對照組相比無顯著性差異（P＞0.05），表明鱷魚肉酶解液碳廓清實驗結(jié)果為陰性。

表3 受試樣品對小鼠碳廓清實驗結(jié)果（±sD，n=10）

表3 受試樣品對小鼠碳廓清實驗結(jié)果（±sD，n=10）

注：與同期模型對照組比較 *P＜0.05

組別 劑量（mL/kg）α值正常對照組 蒸餾水 6.50±0.98*環(huán)磷酰胺模型組 蒸餾水 5.25±1.05 EM低劑量組 0.30 5.68±1.02 EM中劑量組 0.60 5.91±1.17 EM高劑量組 1.80 5.85±0.85

2.4 對小鼠NK細胞免疫實驗結(jié)果

由表4可見，鱷魚肉酶解液高劑量組與正常組比較有顯著性差異（P＜0.05），表明鱷魚肉酶解液的NK細胞免疫實驗結(jié)果為陽性。

表4 受試樣品對原代脾細胞NK計數(shù)及殺傷性實驗結(jié)果（±sD，n=10）

表4 受試樣品對原代脾細胞NK計數(shù)及殺傷性實驗結(jié)果（±sD，n=10）

注：與同期模型對照組比較 * P ＜0.05

組別 給藥劑量（mL/kg）NK（%）正常對照組 蒸餾水 6.43±2.87 EM低劑量 0.30 6.56±2.83 EM中劑量 0.60 8.35±4.55 EM高劑量 1.80 9.55±3.22*

3 討 論

根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003年版）增強免疫力功能實驗結(jié)果判定原則，由于鱷魚肉酶解液的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實驗、血清溶血素實驗及NK細胞活性結(jié)果為陽性，可判定本受試樣品鱷魚肉酶解液在人體推薦用量3.6mL/天劑量上具有增強免疫力功能。

目前國內(nèi)對鱷魚的藥用研究不多，至于藥品和保健品的開發(fā)更是剛剛起步。盡管開發(fā)藥品周期長、風(fēng)險大，但正因為鱷魚經(jīng)濟利用價值極高，醫(yī)藥應(yīng)用前景廣闊，因此，依托綜合利用的效應(yīng)，以中醫(yī)古籍為基礎(chǔ)，借助國內(nèi)外最新研究成果，對鱷魚的藥用價值及其物質(zhì)基礎(chǔ)進行深入研究和開發(fā)，是大有可為的。

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