正交設(shè)計(jì)優(yōu)選冰片脂質(zhì)體的制備工藝

羅 懿 李 珊 歐陽(yáng)榮* 任衛(wèi)瓊 萬(wàn)艷群

（1 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

冰片具有清熱解毒、防腐生肌、抗菌消炎的作用，廣泛用于外用制劑，大多皮膚瘙癢癥患者會(huì)有抓傷、發(fā)紅、發(fā)熱的現(xiàn)象，涂上含有冰片的藥物皮膚有涼感，既可緩解局部癥狀又可抗菌消炎、修復(fù)皮膚，但冰片具有揮發(fā)性，藥效不能持續(xù)，近年來(lái)，脂質(zhì)體（1iposome）以其良好的生物相容性、生物膜相似性、無(wú)毒和促進(jìn)藥物透皮吸收、在皮膚內(nèi)形成藥物儲(chǔ)庫(kù)而維持較恒定的有效濃度等特性引起人們的高度重視。因此，本實(shí)驗(yàn)以薄膜超聲法制備冰片脂質(zhì)體，將部分冰片用脂質(zhì)體包裹，以此減少冰片揮發(fā)并延緩冰片釋放，最終，延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，提高藥物療效。

1 儀器與藥品

天美氣相色譜儀（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；高壓均質(zhì)機(jī)（意大利NIR0?SOAⅥ公司）；Mastersj-zer2000激光粒度測(cè)定儀（英國(guó)Malvem公司）；RE-52c旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；80-2型離心機(jī)（上海浦東物理光華儀器廠）；KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ES-J120型電子分析天平（湖南光明電源）；TEM-100CXⅡ透射電鏡（日本電子公司）；冰片購(gòu)自湖南三湘中藥飲片公司，批號(hào)：20110710，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科藥檢室鑒定均符合2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定；冰片對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110743-200905）；膽固醇（北京市海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基制品廠，批號(hào)：20101129）；大豆卵磷脂（北京華清美恒天然產(chǎn)物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號(hào)：20100523）；羧甲基纖維素鈉（上海山浦化工有限公司，批號(hào)：20110729）；水為二次蒸餾水；試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 冰片的含量測(cè)定[1、2]

2.1.1 色譜條件

石英毛細(xì)管柱（HP-INNDWAX，30 m×250 μm，0.25 μm）；氫火焰離子化檢測(cè)器；柱溫：140℃；檢測(cè)器溫度：250℃；進(jìn)樣口溫度：200℃；載氣（N2）1.0 mL/min；空氣（Air）400 mL/min；氫氣（H2）40 mL/min；分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量：1.0 μL ；分流比為6∶1。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取冰片對(duì)照品31.2 mg,置于10 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成3.12 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.3 供試品溶液的制備

精密移取樣品4.0 mL在10000 r/min的離心機(jī)中離心30 min，取上層液測(cè)游離藥的含量，并記錄上層液體積，將下層沉淀用3.0 mL無(wú)水乙醇破膜，然后在5000 r/min的離心機(jī)中離心 15 min，取上層液測(cè)含量并記錄上層液體積。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密移取對(duì)照品儲(chǔ)備液10.0、7.5、5.0、2.5、0.5、0.25 mL分別置于10 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇稀釋并定容至刻度，搖勻，0.45μm濾膜過濾，取續(xù)濾液依次進(jìn)樣1.0 μL，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=7044.6X+116.67，r=0.9996，表明冰片在0.014～0.554 μg呈良好線性關(guān)系。

2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密移取對(duì)照品溶液1.0 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得冰片質(zhì)量濃度的RSD 2.0%。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別精密移取1.0 μL供試品溶液于0、1、2、3、4、7 h后注入氣相色譜儀，測(cè)得冰片質(zhì)量濃度的RSD 1.30%，表明供試品溶液在7 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

按2.1.3操作制備供試品溶液，依法測(cè)得冰片的平均包封率為89.7%，RSD為1.5%。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn)

取9份1.0mL的空白脂質(zhì)體，分為3組，分別加1.6 mL、2.0 mL、2.4 mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，每一份再加1.0mL無(wú)水乙醇破膜，搖勻，離心，分別得2.39、2.40、2.37；3.38、3.36、3.39；3.90、3.96、3.92 mL上清液，按2.1.1項(xiàng)下測(cè)含量，結(jié)果三種濃度的平均回收率為101.56%，RSD為2.67%。

2.2 脂質(zhì)體的制備[3、4]

2.2.1 正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

在參考相關(guān)文獻(xiàn)及預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，擬用薄膜超聲法來(lái)制備冰片脂質(zhì)體，選擇對(duì)包封率影響較大的以下3個(gè)因素：水化溶液PBS用量A（mL），卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比B（mg/mg），藥脂比C（mg/mg），每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表，進(jìn)行L9（34）優(yōu)化試驗(yàn)。因素水平見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2、方差分析見表3。

表l 因素水平表

表2 L9（34）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

表3 方差分析表

根據(jù)綜合評(píng)分的極差R值可以看出，影響因素的排序?yàn)镃＞A＞B，從K值和直觀比較，得出理論最佳工藝條件為A2B1C3，最終確定的最佳脂質(zhì)體制備工藝條件為卵磷脂300.0 mg，膽固醇50.0 mg，冰片25.0 mg，PBS 20 mL。其中藥物與卵磷脂的比例影響最顯著。

2.2.2 冰片脂質(zhì)體的制備工藝

精密稱取卵磷脂 300.0 mg，膽固醇 50.0 mg，置于500 mL圓底燒瓶中，加入35 mL二氯甲烷使成均一混懸液，將圓底燒瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，40℃恒溫水浴，轉(zhuǎn)速為100 r/min，減壓條件下蒸除二氯甲烷，使膜材在瓶壁上形成均勻的類脂薄膜，將25.0 mg冰片用2 mL無(wú)水乙醇溶解倒入20 mLPBS（PH 6.8）中，再加入一滴吐溫-80，將其混合液倒入具有類脂薄膜的的圓底燒瓶中，在50℃浴式超聲儀中超聲5min，得稀乳狀的脂質(zhì)體懸液，將其在高壓均質(zhì)機(jī)上，90.3KPa壓力下循環(huán)12次，置棕色瓶中密閉保存。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按優(yōu)選處方：卵磷脂300.0 mg，膽固醇50.0 mg，冰片25.0 mg，PBS 20 mL平行制備3批冰片脂質(zhì)體，測(cè)得包封率分別為89.5、89.2、90.3。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明該制備工藝穩(wěn)定。

2.3 冰片脂質(zhì)體的質(zhì)量評(píng)價(jià)[5，6]

2.3.1 顯微觀察

將稀釋后的脂質(zhì)體懸液，點(diǎn)樣于銅網(wǎng)上，用2%的磷鎢酸負(fù)染，用濾紙吸干染液，然后用透射電子顯微鏡觀察并拍照，可見脂質(zhì)體輪廓清晰，呈類圓形或橢圓形，為大單室脂質(zhì)體，隱約可見脂質(zhì)體雙層結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖1。

圖1 冰片脂質(zhì)體電子顯微鏡照片

2.3.2 粒徑與粒度分布

冰片脂質(zhì)體混懸液用 Mastersizer 2000激光粒度測(cè)定儀進(jìn)行粒度分布測(cè)定，粒徑集中分布在50～120 nm內(nèi)。

2.3.3 包封率的測(cè)定[7]

采用高速離心法測(cè)定包封率，精密吸取所制備的脂質(zhì)體混懸液4.0 mL在10000 r/min的離心機(jī)中離心30 min，取上層液測(cè)游離藥的含量，并記錄上層液體積，將下層沉淀用3mL無(wú)水乙醇破膜，然后在5000 r/min的離心機(jī)中離心15 min，取上層液測(cè)含量并記錄上層液體積。包封率E=W1/（W1+ W2）×100%（W1：包封在脂質(zhì)體內(nèi)的藥物的量；W2：未被包封的游離藥物的量）。

3 討 論

3.1 薄膜超聲法制備脂質(zhì)體，在用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除二氯甲烷過程中，水浴溫度應(yīng)控制在40℃以下，溫度太高形成的薄膜不均勻而且超聲時(shí)不易脫離瓶壁；超聲時(shí)，超聲儀中的溫度也不宜太高，太高的溫度冰片容易揮發(fā)。

3.2 為了增加潤(rùn)膚止癢脂質(zhì)體凝膠劑的稠度，改善其涂展性，制備脂質(zhì)體時(shí)，在PBS中加了一滴吐溫-80。

3.3 在預(yù)試驗(yàn)中用微型柱離心法測(cè)包封率誤差很大，所以選擇高速離心法測(cè)包封率較穩(wěn)定，但一種更科學(xué)更先進(jìn)的測(cè)包封率的方法有待于進(jìn)一步研究。

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