小檗堿對(duì)AngⅣ誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響＊

王全華，陳加飛，王 平，吳 芹，蔣青松△

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室 400016；2.重慶科瑞制藥公司 400060；3.遵義醫(yī)學(xué)院藥理教研室，貴州遵義563003）

血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）異常增殖是許多血管增殖性疾病如高血壓、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化和血管成形術(shù)后再狹窄的共同病理基礎(chǔ)[1－2]。抑制VSMCs的異常增殖是治療血管增生性疾病的根本途徑。黃連是中國(guó)傳統(tǒng)中藥，具有“清熱燥濕，瀉火解毒”的功效，對(duì)心血管系統(tǒng)有重要作用。小檗堿（berberine，BBR）是其主要有效成分，近年發(fā)現(xiàn)BBR具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的藥理作用[3]，但其機(jī)制尚未完全明了。血管緊張素Ⅳ（angiotensinⅣ，AngⅣ）是血管緊張素ⅡC末端的六肽片段，也是腎素－血管緊張素系統(tǒng)的重要活性物質(zhì)之一，在VSMCs的異常增殖中亦有重要作用[4]。那么，對(duì)于AngⅣ誘導(dǎo)的VSMCs增殖，BBR會(huì)產(chǎn)生什么樣的影響？本實(shí)驗(yàn)利用大鼠VSMCs離體培養(yǎng)模型首次進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與主要試劑 清潔級(jí)Sprague－Dawley大鼠，體質(zhì)量（165±15）g，雄性，8只，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證：SCXK（渝）2007－0005。BBR粉劑購(gòu)自四川亞寶光泰制藥有限公司；L－精氨酸、NG－硝基－L－精氨酸甲酯（NGnitro－L－arginine－methyl ester，L－NAME）、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型）、總一氧化氮（nitric oxide，NO）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自江蘇碧云天公司；AngⅣ、噻唑藍(lán)（MTT）、胰蛋白酶均購(gòu)自Sigma公司；一氧化氮合酶（NO synthase，NOS）測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Trizol試劑和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?GREEN PCR Master Mix（ABI）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)與分組 參考徐正云等[5]貼塊法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)所用VSMCs均為第3～8代傳代細(xì)胞。分為6組，（1）對(duì)照組：加入等體積含10%血清DMEM培養(yǎng)液；（2）AngⅣ（0.1 nmol／L）組；（3）AngⅣ（0.1 nmol／L）＋不同濃度BBR（10、30、100μmol／L）組；（4）L－精氨酸（1 mmol／L）＋AngⅣ（0.1 nmol／L）組；（5）AngⅣ（0.1 nmol／L）＋L－NAME（1 mmol／L）＋L－精氨酸（1 mmol／L）組；（6）AngⅣ（0.1 nmol／L）＋L－NAME（1 mmol／L）＋BBR（30μmol／L）組。

1.2.2 MTT法檢測(cè)VSMCs增殖作用 在96孔板中以5×103細(xì)胞／孔的密度鋪板。70%～80%融合后，用無(wú)血清DMEM同步化24 h，更換含10%血清DMEM，同時(shí)加入不同試藥48 h后，每孔加入MTT（5 g／L）10μL孵育4 h，棄上清液，每孔加DMSO 100μL，震蕩混合10 min，在酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm波長(zhǎng)的吸光度（A490）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.2.3 細(xì)胞總蛋白含量測(cè)定 細(xì)胞密度為5×104個(gè)／mL，接種于24孔板，加入RIPA裂解緩沖液，冰浴條件下超聲破碎細(xì)胞，10 s×3次；4℃，12 000×g離心20 min，取上清液按BCA蛋白檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作。重復(fù)6次。

1.2.4 Real－time RT－PCR測(cè)定了內(nèi)皮型NOS（endothelial NOS，eNOS）mRNA表達(dá) 細(xì)胞密度為5×104個(gè)／mL，接種于25 mL培養(yǎng)瓶中。Trizol提取RNA，按照兩步法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（反應(yīng)條件：第1步，95℃×3 min；第2步，95℃×10 s，退火溫度均為60℃×45 s，循環(huán)40次）。以βactin為內(nèi)參，用相對(duì)定量法計(jì)算eNOS mRNA的表達(dá)。每組重復(fù)4次。引物序列，eNOS，sense：5′－CCT CGT GGT AGC GTT GCT GA－3′，antisense：5′－AGC TGG TGA AGC CGG TGA C－3′；β－actin，sense：5′－GGC CAA CCG TGA AAA GAT GA－3′，antisense：5′－CAG CCT GGA TGG CTA CGT ACA－3′，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2.5 NOS活性及NO含量測(cè)定 5×104細(xì)胞／孔接種于24孔板中，取培養(yǎng)細(xì)胞上清液，用721分光光度計(jì)測(cè)定530 nm波長(zhǎng)吸光度，按照試劑盒說(shuō)明書操作，計(jì)算NOS活性；或用酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm波長(zhǎng)吸光度，按照試劑盒說(shuō)明書作并計(jì)算NO含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以±s表示，多組間兩兩比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BBR對(duì)VSMCs增殖的影響 與對(duì)照組相比，AngⅣ0.1 nmol／L具有明顯的促進(jìn)VSMCs增殖的作用，其A490與蛋白含量分別增加了14.3%和14.0%（P＜0.01）。BBR（10、30、100μmol／L）呈濃度依賴性抑制AngⅣ誘導(dǎo)的VSMCs增殖，使A490分別降低了6.8%、12.2%和19.4%（P＜0.01）；蛋白含量分別降低了3.2%、9.8%和19.6%（P＜0.01）。見表1。NO供體L－精氨酸（1 mmol／L）也可以抑制AngⅣ誘導(dǎo)的VSMCs增殖，A490與蛋白含量分別降低了3.8%和18.1%（P＜0.01）。NOS抑制劑L－NAME（1 mmol／L）可以抵消BBR與L－精氨酸的作用（P＜0.05）。見圖1。

2.2 BBR對(duì)VSMCs中eNOS mRNA表達(dá)的影響 正常VSMCs中eNOS mRNA表達(dá)較高，AngⅣ使其明顯降低（P＜0.01）。BBR 30μmol／L明顯改善AngⅣ的作用，使e NOS m RNA表達(dá)增加了195.2%（P＜0.01）。L－精氨酸亦可上調(diào)AngⅣ降低的e NOS m RNA表達(dá)（P＜0.05）。L－NAME可以取消BBR和L－精氨酸的作用（P＜0.05）。見圖2。

表1 BBR對(duì)AngⅣ誘導(dǎo)大鼠VSMCs增殖的抑制作用（±s，n＝6）

表1 BBR對(duì)AngⅣ誘導(dǎo)大鼠VSMCs增殖的抑制作用（±s，n＝6）

＃：P＜0.01，與對(duì)照組比較；＊：P＜0.01，與AngⅣ組比較。

組別 A490總蛋白水平（μg／μL）對(duì)照組0.244±0.010 0.349±0.066 AngⅣ0.1 nmol／L組 0.279±0.007＃0.398±0.075＃BBR 10μmol／L＋AngⅣ0.1 nmol／L組0.260±0.004＊0.385±0.066 BBR 30μmol／L＋AngⅣ0.1 nmol／L組0.245±0.010＊0.359±0.068＊BBR 100μmol／L＋AngⅣ0.1 nmol／L組0.225±0.014＊0.320±0.053＊

圖1 L－NAME對(duì)BBR抑制AngⅣ誘導(dǎo)大鼠VSMCs增殖的影響（±s，n＝6）

圖2 BBR對(duì)AngⅣ誘導(dǎo)大鼠VSMCs eNOS mRNA表達(dá)的影響（±s，n＝4）

表2 BBR對(duì)AngⅣ誘導(dǎo)大鼠VSMCs NOS活性和NO 含量的影響（±s，n＝6）

表2 BBR對(duì)AngⅣ誘導(dǎo)大鼠VSMCs NOS活性和NO 含量的影響（±s，n＝6）

＃＃：P＜0.01，與對(duì)照組比較；＊＊：P＜0.01，＊：P＜0.05，與AngⅣ組比較。

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2.3 BBR對(duì)AngⅣ誘導(dǎo)VSMCs中NOS活性及NO含量的影響 AngⅣ明顯降低細(xì)胞上清液中NOS活性和NO含量，使其分別降低了45.6%和26.5%（P＜0.01），BBR使之明顯增加（P＜0.05），以30μmol／L作用最強(qiáng)，二者分別增加了68.1%（P＜0.01）和35.0%（P＜0.01）。見表2。L－精氨酸的作用與BBR相似，也使NOS活性及NO含量分別提高了34.4%和92.6%（P＜0.05）。L－NAME亦可以抵消BBR與L－精氨酸的上述作用（P＜0.05）。見圖3。

圖3 L－NAME對(duì)BBR增加AngⅣ誘導(dǎo)大鼠VSMCs NOS活性和NO含量的影響（±s，n＝6）

3 討 論

VSMCs增生是心腦血管疾病發(fā)生和發(fā)展的病理學(xué)基礎(chǔ)，對(duì)其研究一直是相關(guān)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。AngⅣ作為腎素－血管緊張素系統(tǒng)的一員，在心血管系統(tǒng)的病理生理過(guò)程中也有重要影響[6]，但目前的研究主要集中在血管緊張素Ⅱ的作用方面。本研究結(jié)果顯示，AngⅣ在納摩爾水平（0.1 nmol／L）可刺激VSMCs數(shù)量增多，總蛋白含量升高。與Ruiz－Ortega等[6]的報(bào)道一致，提示AngⅣ亦是一個(gè)促進(jìn)VSMCs增殖的獨(dú)立因素。

研究已經(jīng)證實(shí)[7－8]，中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對(duì)于很多慢性疾病具有獨(dú)特的治療作用，現(xiàn)已經(jīng)有很多中藥活性成分應(yīng)用于臨床。BBR是目前臨床常用的一個(gè)毒性較低的中藥單體，在毛茛科植物黃連、蕓香科植物黃檗、小檗科植物小檗中含量較高。最近的研究證明，BBR對(duì)心血管疾病具有良好的改善作用，包括抗心肌缺血、降血壓、降血糖、降低膽固醇以及抗動(dòng)脈粥樣硬化等[3，9]。已有 研究證 明，BBR可能通過(guò)AMPK／p53／p21及ERK等通路的作用，抑制VSMCs處于G0期，從而抑制VSMCs的增殖[3－4，10]。本研究顯示，BBR能夠濃度依賴地抑制AngⅣ誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞數(shù)量增多和總蛋白升高，提示BBR具有抗AngⅣ誘導(dǎo)VSMCs增殖的作用。但在此過(guò)程中，是否還有別的因子參與？本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了進(jìn)一步研究。

在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，NO是一個(gè)重要的參與因子。現(xiàn)已證明[11]，NO具有調(diào)節(jié)血壓、抑制血小板聚集、抑制白細(xì)胞黏附和抑制VSMCs增殖等作用。許多研究證實(shí)，BBR的心血管作用與其活化eNOS，促進(jìn)NO的釋放有關(guān)[12－14]。但eNOS－NO信號(hào)通路的激活是否也參與了BBR的抗AngⅣ誘導(dǎo)VSMCs增殖作用，目前尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，AngⅣ誘導(dǎo)VSMCs增殖的同時(shí)，eNOS mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，NOS活性降低，NO含量減少。與NO供體L－精氨酸的作用相似，BBR抗AngⅣ誘導(dǎo)VSMCs增殖的同時(shí)，明顯上調(diào)eNOS mRNA的表達(dá)，提高NOS活性，增加NO的釋放。NOS抑制劑L－NAME可阻斷L－精氨酸和BBR的上述作用。這些結(jié)果提示，促進(jìn)NO釋放增加可能是BBR抑制AngⅣ誘導(dǎo)VSMCs增殖的機(jī)制之一。

綜上所述，BBR具有抗AngⅣ誘導(dǎo)的VSMCs增殖的作用；該作用的產(chǎn)生可能與其上調(diào)e NOS－NO信號(hào)通路，最終使NO釋放增加有關(guān)。

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