LC3在早期糖尿病大鼠腎臟中的表達(dá)及意義＊

顏曉勇，張茂平，吳蔚樺

（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，貴州遵義563003；2.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院腎內(nèi)科，四川瀘州646000）

糖尿病腎?。╠iabetes nephropathy，DN）為糖尿病最常見、最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致終末期腎功能衰竭和糖尿病致死的主要原因。自噬（autophagy）是細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程，是真核細(xì)胞特有的生命現(xiàn)象，自噬性細(xì)胞死亡有別于凋亡（Ⅰ型程序性死亡），而被稱為Ⅱ型程序性死亡。近年來的研究提示，細(xì)胞自噬在腎臟疾病中扮演重要的角色，特別是足細(xì)胞病[1－2]，如微小病變腎病、局灶性節(jié)段性腎小球硬化（FSGS）、膜性腎病、DN等，推測細(xì)胞自噬與DN的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，然而這方面的研究還鮮見報道。本研究檢測了DN大鼠模型各時間點細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白——微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule－associated protein 1 light chain 3，LC3）的表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡水平，探討其關(guān)系和意義，為進(jìn)一步研究DN發(fā)病機(jī)制和干預(yù)治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組與模型制備 成年雄性SD大鼠48只，8周齡，體質(zhì)量（230±20）g，購至四川大學(xué)實驗動物中心。標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)房籠子喂養(yǎng)。設(shè)模型組和正常對照組，每組設(shè)2、4、6和8周，共4個觀察時間點，各組每個時間點6只大鼠。模型組采用1%鏈脲菌素（STZ，Sigma公司）55 mg／kg一次性腹腔內(nèi)注射誘導(dǎo)造模。72 h后至少連續(xù)3 d尾靜脈采血測血糖，以連續(xù)3次血糖大于16.7 mmol／L，尿量大于原尿量的150%，尿蛋白排泄大于30 mg／24 h者為成模標(biāo)準(zhǔn)[3]。正常對照組用同劑量的生理鹽水腹腔注射。各實驗組均采用相同的大鼠標(biāo)準(zhǔn)食物和飲用水，成模后均未使用降糖藥。每周測定1次血糖、尿蛋白，并定期監(jiān)測一般項目。

表1 兩組大鼠血糖、KI、尿蛋白及Ccr比較（n＝6）

1.2 標(biāo)本收集與生化指標(biāo)檢測 在實驗的2、4、6、8周分別通過尾靜脈測量大鼠血糖，并將每只大鼠放入代謝籠留取24 h尿液，記錄24 h尿量，檢測24 h尿白蛋白量（ualb）和24 h尿肌酐濃度（ucrea）；同時從兩組中隨機(jī)選取6只大鼠處死，測量大鼠體質(zhì)量；股靜脈取血5 mL檢測血清肌酐（Cr）。經(jīng)腹主動脈灌注生理鹽水后摘取腎臟，立即將右腎組織存入―80℃低溫冰箱；稱取左腎質(zhì)量，取左腎組織10%甲醛固定，待作病理學(xué)檢查。計算內(nèi)生肌酐清除率（Ccr）和腎臟肥大指數(shù)（KI），公式為：Ccr＝[尿肌酐（mmol／L）×尿量（mL）×100]／[血肌酐（mmol／L）×體質(zhì)量（g）×1 440]，KI＝腎質(zhì)量／體質(zhì)量。

1.3 腎臟病理學(xué)檢測 普通HE染色，觀察兩組各時點腎小球、腎小管間質(zhì)病變。

1.4 腎臟LC3免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，3%H2O2甲醇液浸泡，微波修復(fù)抗原，正常羊血清封閉，先后滴加稀釋的一抗（兔抗大鼠LC3抗體，英國Abcam公司），羊抗兔二抗，ABC復(fù)合物及DAB顯色劑，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，甘油明膠封片。以PBS代替一抗作為對照。先低倍鏡下觀察著染情況，再在高倍鏡下隨機(jī)選皮質(zhì)區(qū)30個腎小球，采用全自動圖像分析系統(tǒng)（Image－proplus 6.0）分別計數(shù)其積分光密度（IOD）值，取其均值分析。

1.5 原位末端標(biāo)記法（TUNEL）染色觀察凋亡細(xì)胞 石蠟切片5μm，二甲苯脫蠟，PBS沖洗，胃蛋白酶消化，PBS沖洗；加TUNEL反應(yīng)液（武漢博士德公司提供）37℃孵育60 min，PBS沖洗；加堿性磷酸酶抗體37℃孵育30 min，PBS沖洗；加1～2滴BCIP／NBT，室溫下孵育10～30 min，PBS沖洗；蘇木素復(fù)染；水性封片劑封片、烘干，光鏡觀察細(xì)胞核紅色為陽性。在光鏡下（×400），每組取6個樣本，每個樣本計數(shù)5個不同視野凋亡的腎小管細(xì)胞數(shù)，與同視野腎小管細(xì)胞總數(shù)的百分比率，計算其均值，以確定平均凋亡指數(shù)[4]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以±s表示，方差不齊時行數(shù)據(jù)對數(shù)變換使其方差齊，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK－q檢驗；兩組均數(shù)比較采用獨立樣本均數(shù)t檢驗；變量間的關(guān)系判斷采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠腎臟病理學(xué)比較 腎臟病理HE染色顯示正常對照組腎小球、腎小管間質(zhì)、腎臟血管未發(fā)現(xiàn)明顯異常，而模型組2周即出現(xiàn)明顯腎小球增大，系膜基質(zhì)逐漸增多，系膜細(xì)胞增多，小管擴(kuò)張。

2.2 兩組大鼠血糖、KI、尿蛋白及Ccr比較 兩組大鼠血糖、KI、尿蛋白及Ccr比較見表1。

2.3 兩組大鼠LC3免疫組化結(jié)果比較 LC3主要表達(dá)于腎小管，模型組2、4、6、8周腎臟LC3陽性產(chǎn)物（棕黃色）IOD值均弱于對照組（P＜0.05）；模型組各時點間LC3陽性產(chǎn)物IOD值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖1。

圖1 LC3在大鼠腎組織中的表達(dá)情況（免疫組化染色）

2.4 兩組大鼠細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 模型組2、4、6、8周腎臟凋亡細(xì)胞增多（紅色為凋亡細(xì)胞），主要出現(xiàn)于腎小管，其凋亡指數(shù)均高于對照組（P＜0.05）；模型組各時點凋亡指數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2。

A：對照組；B、C、D、E：模型組2、4、6、8周。

2.5 相關(guān)性分析 模型組LC3表達(dá)量與尿蛋白、KI呈負(fù)相關(guān)（r＝―0.604，P＜0.01；r＝―0.653，P＜0.01）；模型組腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)與尿蛋白、KI呈正相關(guān)（r＝0.829，P＜0.01；r＝0.801，P＜0.01）；LC3表達(dá)量與細(xì)胞凋亡指數(shù)呈負(fù)相關(guān)（r＝―0.835，P＜0.01）。

3 討 論

DN的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，近年來的研究提示，自噬在腎臟疾病中扮演重要的角色，推測細(xì)胞自噬可能與糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。本研究顯示：LC3主要表達(dá)于腎小管，模型組2、4、6、8周腎臟LC3陽性產(chǎn)物（棕黃色）IOD值均弱于對照組（P＜0.05）；模型組各時點間LC3陽性產(chǎn)物IOD值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；模型組LC3的表達(dá)量與尿蛋白、KI呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。提示自噬的缺乏可能促進(jìn)了早期DN的發(fā)展。自噬在細(xì)胞和組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用：（1）基礎(chǔ)性的自噬有修復(fù)細(xì)胞和維持細(xì)胞生命的作用；（2）過量的自噬會導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡[5]。細(xì)胞自噬水平的降低使其對腎臟細(xì)胞的修復(fù)和生命維持功能減弱，引起腎小管功能障礙，對蛋白的重吸收減少和適應(yīng)細(xì)胞代謝負(fù)荷增加的功能亦減弱，從而可能導(dǎo)致腎臟損傷。

糖尿病時，內(nèi)皮細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子表達(dá)增加而使胞內(nèi)葡萄糖含量增加[6]，進(jìn)而增加了細(xì)胞內(nèi)活性氧，這可能是糖尿病腎病凋亡增加的主要機(jī)制[7]。這與本研究結(jié)果相一致，模型組2、4、6、8周腎臟凋亡細(xì)胞增多（紅色為凋亡細(xì)胞），主要出現(xiàn)于腎小管，其凋亡指數(shù)均高于對照組（P＜0.05）；模型組各時點凋亡指數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；模型組腎小管細(xì)胞凋亡指數(shù)與尿蛋白、KI呈正相關(guān)（P＜0.01）。表明細(xì)胞凋亡與早期糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)LC3蛋白表達(dá)量與腎小管細(xì)胞凋亡指數(shù)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01），且細(xì)胞自噬減弱和凋亡增多均主要發(fā)生在同一部位——腎小管。細(xì)胞自噬可以單獨通過細(xì)胞保護(hù)作用或自身破壞吞噬作用決定細(xì)胞的生存和死亡，也能通過比較復(fù)雜的機(jī)制與細(xì)胞凋亡聯(lián)系起來，從而對細(xì)胞產(chǎn)生影響。盡快地清除細(xì)胞凋亡殘余物是防止組織損傷的關(guān)鍵[8]。有研究表明自噬基因atg5缺失的胚胎同時具有凋亡細(xì)胞清除不足和組織損傷[9]。不能有效的清除凋亡細(xì)胞會引起組織對自身抗原的耐受，從而導(dǎo)致自身免疫性疾病[8]。細(xì)胞自噬對凋亡細(xì)胞及其產(chǎn)物的清除不足，可導(dǎo)致組織損傷和炎癥，這一機(jī)制可能也參與了DN的發(fā)生、發(fā)展。然而，細(xì)胞自噬在DN中的作用及其與細(xì)胞凋亡相互作用的具體機(jī)制，調(diào)高細(xì)胞自噬和減少細(xì)胞凋亡是否有助DN微血管病變的改善值得進(jìn)一步研究。

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