NEK2及ERK2在乳腺癌中的表達(dá)及意義

邱 鵬，王小玲

乳腺癌是目前女性最常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率有上升且年輕化的趨勢(shì)，乳腺癌的發(fā)生與其他惡性腫瘤一樣，都是一個(gè)多基因參與并經(jīng)多步驟的復(fù)雜生理過程，在這一過程中存在很多細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常，因此，研究乳腺癌中細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)早期預(yù)防乳腺癌的發(fā)生具有重要意義。絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen－activated proteinkinases，MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常與多種腫瘤或增殖性疾病關(guān)系密切［1］。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 (ERK2)為MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的重要因子［2］。N絲/蘇氨酸蛋白激酶 (IMA)相關(guān)蛋白激酶 (NEK)被發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞有絲分裂的調(diào)控，已被稱為有絲分裂酶第三家族［3］。NEK2是Nek家族中最具特征性和代表性的一員。本研究旨在通過檢測(cè)乳腺癌中NEK2、ERK2蛋白的表達(dá)，分析其表達(dá)并探討其與乳腺癌病理、臨床特征的關(guān)系，為乳腺癌的早期診斷、轉(zhuǎn)移的監(jiān)測(cè)、預(yù)后評(píng)價(jià)等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料標(biāo)本 選取邢臺(tái)市人民醫(yī)院病理科2009年3月—2011年3月住院手術(shù)的乳腺組織存檔蠟塊，組織來源均為女性患者，所有標(biāo)本經(jīng)病理學(xué)證實(shí)，均未進(jìn)行任何術(shù)前放療、化療及內(nèi)分泌治療，也未進(jìn)行腋窩淋巴結(jié)活檢手術(shù)以及腋窩的其他手術(shù);均行乳腺癌改良根治術(shù)或乳腺腫物切除術(shù)。患者術(shù)前臨床資料完整，術(shù)后相關(guān)病理資料完善。其中乳腺浸潤(rùn)性癌86例 (浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌50例，浸潤(rùn)性小葉癌27例，髓樣癌6例，黏液癌4例)作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)以20例乳腺組織 (均取自乳腺癌標(biāo)本距腫物5cm以上的乳腺組織)作為陰性對(duì)照組，乳腺原位癌10例為陽(yáng)性對(duì)照組。

1.2 主要試劑 鼠抗人單克隆抗體NEK2購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，兔抗人多克隆抗體ERK2購(gòu)自上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司。S－p試劑盒及DAB顯色劑均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。用PBS代替一抗做陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷 NEK2蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要在胞漿可見胞核表達(dá)。ERK2蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要在胞質(zhì)，可見胞核表達(dá)。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)［5］。每張切片在光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，著色強(qiáng)度分為無色為0分，淺黃色為1分，黃色及棕黃色為2分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%為0分;10% ～50%為1分;＞50%為2分，兩項(xiàng)得分相乘后分為2級(jí)，結(jié)果≥2為陽(yáng)性，＜2為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件，采用χ2檢驗(yàn)、Fisher's確切概率法及相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NEK2和ERK2在乳腺組織、乳腺原位癌和浸潤(rùn)性癌組織中的表達(dá) 在乳腺組織、乳腺原位癌和浸潤(rùn)性癌組織中的NEK2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為10.0%、50.0%、87.2%，且存在顯著性差異。ERK2蛋白在3組表達(dá)率分別為10.0%、80.0%、96.7%，在乳腺原位癌及乳腺浸潤(rùn)性癌中ERK2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)均高于正常乳腺組織組，有顯著性差異，乳腺浸潤(rùn)性癌組的陽(yáng)性表達(dá)率雖然高于乳腺原位癌組，但無顯著性差異(P＜0.05，見表1)。

表1 NEK2和ERK2在不同患者中的表達(dá)情況Table 1 Expression of NEK2、ERK2 in different patients

2.2 NEK2和ERK2在不同病例中的表達(dá)情況的相關(guān)性 在乳腺癌變過程中NEK2和ERK2呈正相關(guān)關(guān)系 (r=0.447，P=0.000)。

2.3 NEK2和ERK2和蛋白在浸潤(rùn)性乳腺癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 NEK2蛋白和ERK2蛋白的表達(dá)均與患者發(fā)生腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理學(xué)分級(jí)及臨床分期呈明顯正相關(guān)，而與患者的年齡，腫物大小，月經(jīng)情況，組織分型無關(guān) (見表2)。

表2 NEK2和ERK2的臨床病理關(guān)系Table 2 Relation of clinical pathology between NEK2 and ERK2

3 討論

20世紀(jì)80年代中期，nimA被克隆出來并證明其編碼一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，該激酶被命名為NIMA。NIMA具有氨基末端激酶區(qū)域，可以優(yōu)先識(shí)別底物氨基酸疏水殘基;還帶有未催化的卷曲螺旋區(qū)域的羧基末端，一旦被催化將對(duì)NIMA低聚體的形成起重要作用。目前，公認(rèn)的人類Nek家族共有11個(gè)成員，均與NIMA有相似的氨基催化區(qū)基因序列，而由于羧基末端長(zhǎng)度不同而分化。NEK2和NIMA同源性最高，有44%相同的催化區(qū)氨基酸序列［5］。NIMA相關(guān)蛋白激酶被稱為有絲分裂酶的第三家族。雖然這些酶的功能性特征鑒定還處于早期階段，大部分還知之甚少，但現(xiàn)已明確Nek具有與細(xì)胞周期相關(guān)的功能。研究者發(fā)現(xiàn)多種腫瘤如前列腺癌、宮頸癌等存在中心體異常，且常同時(shí)伴有染色體的不穩(wěn)定［6］，NEK2和中心體的關(guān)系密切。NEK2包含3種剪接異構(gòu)體NEK2A、NEK2B、NEK2C，3者的N端相同，羧基端不同，不同剪接異構(gòu)體在細(xì)胞內(nèi)可形成同或異二聚體。NEK2A的C端可與染色質(zhì)凝縮相關(guān)MAPK通路中的Erk2結(jié)合。NEK2既參與中心體分離又參與染色質(zhì)凝縮及染色體分離，因此其可間接調(diào)節(jié)中心體或直接干擾染色體而影響整個(gè)基因組的穩(wěn)定，從而促使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及浸潤(rùn)。

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 (extrallular signal regulatedprotein kinase，ERK1/2)是20世紀(jì)90年代初期分離鑒定的一種蛋白激酶，相對(duì)分子質(zhì)量分別為44×103和42×103，有90%的同源性。其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育及分化的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的核心，細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)分子最終通過磷酸化ERK1/2發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。作為絲原活化蛋白激酶家族的一員，其基本的信號(hào)傳遞步驟遵循絲裂原活化蛋白激酶的三級(jí)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)，即Ras→Raf→絲裂原活化蛋白激酶的激酶 (mitogen－activated protein kinase kinase，MEK)→ERK途徑。ERK蛋白是通過以下方面來參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展的:(1)ERK調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖。其中ERK2的過度表達(dá)刺激相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞的分化，凋亡，增殖等，ERK2的作用之一是參與細(xì)胞周期的調(diào)控。(2)ERK作用于凋亡相關(guān)因子而抑制凋亡，促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展。(3)ERK促進(jìn)乳腺癌的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。

本研究采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)乳腺癌NEK2蛋白、ERK2蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NEK2蛋白在乳腺原位癌及乳腺浸潤(rùn)性癌的表達(dá)明顯高于乳腺組織。乳腺浸潤(rùn)性癌中的表達(dá)明顯高于乳腺原位癌，差異均有顯著性，說明NEK2蛋白參與了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。許多研究已明確乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展與中心體的異常相關(guān)，而NEK2蛋白與中心體的關(guān)系密切，本研究與此結(jié)論相符。ERK2蛋白在乳腺原位癌及乳腺浸潤(rùn)性癌的表達(dá)明顯高于乳腺組織。雖然乳腺浸潤(rùn)性癌和乳腺原位癌的表達(dá)差異無顯著性，但在乳腺浸潤(rùn)性癌的表達(dá)高于乳腺原位癌，說明ERK2蛋白參與了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，考慮主要是通過Ras→Raf→MEK→ERK途徑來參與的。

在浸潤(rùn)性乳腺癌中ERK2陽(yáng)性表達(dá)的78例中NEK2陽(yáng)性表達(dá)72例，陰性表達(dá)6例，ERK2陰性表達(dá)的8例中NEK2陰性表達(dá)5例，陽(yáng)性表達(dá)3例。ERK2與NEK2在乳腺浸潤(rùn)性癌中的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。Ras－Raf－MEK－ERK細(xì)胞信號(hào)傳遞通路是由一個(gè)小GTP蛋白連接活化的受體酪氨酸激酶和胞漿蛋白組成的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。許多研究已經(jīng)證實(shí)這個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路參與乳腺癌的發(fā)生過程。ERK1/2的活化是將信號(hào)從細(xì)胞膜表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)致核的關(guān)鍵，有研究表明ERK2與細(xì)胞周期的關(guān)系密切。與染色質(zhì)凝縮相關(guān)MAPK通路中的 Erk2可與NEK2A的C端結(jié)合［7］，促進(jìn)NEK2間接調(diào)節(jié)中心體或直接干擾染色體而影響整個(gè)基因組的穩(wěn)定，從而促使細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。

NEK2、ERK2蛋白在浸潤(rùn)性乳腺癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系方面，從研究結(jié)果來看，NEK2蛋白和ERK2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組均高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，均隨著病理分期的升高而增高，隨著組織學(xué)分級(jí)的升高陽(yáng)性表達(dá)率逐漸增加，且差異有顯著性。NEK2蛋白和ERK2蛋白隨著年齡的增加，陽(yáng)性表達(dá)率均降低，但差異無顯著性。NEK2蛋白和ERK2蛋白均與患者年齡、腫物直徑、有無停經(jīng)史、不同的組織分型 (乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、浸潤(rùn)性小葉癌、黏液癌、髓樣癌)無明顯相關(guān)關(guān)系。Tsuneda等［8］發(fā)現(xiàn)用siRNA干擾NEK2表達(dá)在降低乳腺癌細(xì)胞增殖能力的同時(shí)還可降低其體外浸潤(rùn)能力，同樣在裸鼠模的乳腺腫物周圍注射NEK2 siRNA也可顯著抑制腫物生長(zhǎng)。表明NEK2的表達(dá)升高促進(jìn)乳腺癌的浸潤(rùn)。本研究結(jié)果和以上研究結(jié)果相符，NEK2可能和乳腺癌的預(yù)后有關(guān)。應(yīng)用免疫組化和Western Blot方法對(duì)乳腺癌的研究表明，ERK2在乳腺癌中的表達(dá)與臨床分期呈正相關(guān)［9－10］。然而，Milde等［9］研究表明，乳腺癌ERK2與臨床分期無關(guān)，本研究與前者結(jié)果相同。提示ERK2參與浸潤(rùn)性乳腺癌發(fā)生及進(jìn)展，并和乳腺癌的預(yù)后有一定的關(guān)系。Ras→Raf→MEK→ERK細(xì)胞信號(hào)傳遞通路在乳腺癌中的作用已被證實(shí)，NEK2是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子。本研究通過細(xì)胞信號(hào)傳遞通路的終極因子ERK2與細(xì)胞周期因子NEK2的關(guān)系來探討細(xì)胞信號(hào)傳遞通路和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)之間的聯(lián)系，有一定的創(chuàng)新性。且NEK2蛋白是最近發(fā)現(xiàn)的與中心體關(guān)系密切的因子，其在乳腺癌的意義目前少有研究。而其組織表達(dá)及作用機(jī)制的獨(dú)特性在腫瘤診斷、預(yù)后評(píng)價(jià)及靶向治療等方面會(huì)有進(jìn)一步的研究及應(yīng)用，為腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、早期診治提供依據(jù)。

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