豬鸚鵡熱衣原體的分離與鑒定

歐陽金旭 (長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

熊 濤 (長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

楊玉瑩 (長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

豬鸚鵡熱衣原體的分離與鑒定

歐陽金旭 (長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

熊 濤 (長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

楊玉瑩 (長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

以新鮮豬糞便為材料，采用雞胚分離培養(yǎng)法從荊州地區(qū)的豬群中分離出 4株鸚鵡熱衣原體 ，通過光學(xué)顯微鏡檢查、藥敏試驗、碘染試驗和動物致病性試驗對 4株衣原體進行了鑒定 。結(jié)果表明 ，所分離的4株衣原體均為鸚鵡熱衣原體。

豬群；鸚鵡熱衣原體；雞胚；分離培養(yǎng)；鑒定

衣原體是衣原體科衣原體屬的嚴(yán)格的細胞內(nèi)寄生微生物。最新研究認為，衣原體屬有4個種，即沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)、 鸚 鵡 熱 衣 原 體 (C.psittaci)、肺炎衣原體 (C.pnewnonioe)和反芻動物衣原體 (C.pecorum)。動物衣原體病主要是由鸚鵡熱衣原體及反芻動物衣原體引起的一種多癥候傳染病。鸚鵡熱衣原體可感染禽類引起禽衣原體病，名鸚鵡熱或鳥疫，也感染其他脊椎動物如牛、豬、山羊、綿羊等。反芻動物衣原體目前只從哺乳動物分離到，如牛、綿羊、山羊、樹袋熊(Koala)、豬[1]。盧國棟等[2]報道豬衣原體對四環(huán)素類抗生素、紅霉素、夾竹桃霉素、泰樂菌素、強力霉素、氯霉素及螺旋霉素敏感，對慶大霉素、新霉素、鏈霉素及磺胺嘧啶鈉不敏感。衣原體含有DNA和RNA，以二分裂方式增殖，在細胞胞質(zhì)內(nèi)可形成包涵體，易被堿性染料著染。用Giemsa、Gimenez、Ziehl/Neelsen、Macchiavello、Castameda等染色法著色良好。能在雞胚和McCoy細胞、鼠L細胞、Hela細胞、Vero細胞、BHK21細胞、BGM細胞、Chang氏人肝細胞內(nèi)生長繁殖，繁殖過程中會產(chǎn)生2種大小不同的顆粒，較小的為原生小體(Elementary body，EB)，直徑0.2～0.5μm，呈球形或卵圓形，有傳染性[3]。

20世紀(jì)90年代初期以來，隨著我國集約化養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，動物衣原體的感染呈現(xiàn)上升趨勢。目前最有效的防治動物衣原體感染的措施就是接種安全、有效的疫苗。但由于生物學(xué)特性和免疫學(xué)機制的復(fù)雜性，衣原體感染后寄生于宿主細胞內(nèi)反而受到宿主細胞的保護，目前研制的多種減毒活疫苗、滅活苗是否能很好地誘導(dǎo)特異性免疫力的產(chǎn)生而不引起其他副作用，以及其有效性和穩(wěn)定性等都尚待進一步證實。因此，對衣原體進行分離鑒定十分重要。動物衣原體病是一種人畜共患病，禽衣原體病與哺乳動物衣原體病比較，前者對人類健康的危害性更嚴(yán)重[4-5]。做好動物衣原體病的防治工作，在一定程度上能保障人民的財產(chǎn)和人生安全，具有巨大的經(jīng)濟效益和社會效益，對國家“三農(nóng)”政策的實施具有重大的實踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

SPF雞胚由山東無特定病原雞實驗種雞場提供；新鮮的豬糞便由湖北荊州某豬場采集；衣原體標(biāo)準(zhǔn)株及小牛血清由長江大學(xué)動物病原與分子生物學(xué)實驗室提供。

1.2 病料的處理

采取豬新鮮糞便，加入5倍稀釋液(0.01mol/L，pH7.4 PBS溶液)混合，再加入慶大霉素100μg/ml，硫酸鏈霉素1mg/ml，兩性霉素10μg/ml，37℃水浴感作1h。于4℃下，500g離心10min，取上清液按1∶10與細胞營養(yǎng)液(即小牛血清)混合，加鏈霉素500μg/ml。4℃下，1500g離心20min。取上清液按1∶5與細胞營養(yǎng)液(同上)混合，4℃下，2000g離心20min，取上清液4℃保存待用。

1.3 衣原體分離培養(yǎng)

(1)雞胚接種 取上述處理后病料以卵黃囊腔接種6～8日齡健康雞胚，每個雞胚接種0.12ml。逐日觀察雞胚死亡情況，棄去2日內(nèi)死亡雞胚，如果超過6日內(nèi)雞胚沒有死亡，則收獲雞胚卵黃囊膜，處理后盲傳3代。

(2)收獲雞胚 收集4～6日齡死亡雞胚，無菌操作收取雞胚卵黃囊膜，置于無菌瓶中，另取少量卵黃囊涂片待鏡檢。

(3)染色鏡檢 涂片后自然干燥，然后經(jīng)甲醇固定5min，干燥后用姬姆薩氏染色液染色30～60min。以pH7.2磷酸緩沖液或中性蒸餾水沖洗，待干后在光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況。

1.4 衣原體的鑒定

(1)藥敏試驗 參照文獻[6]的方法進行。選取硫酸鏈霉素、磺胺嘧碇鈉、青霉素、氯霉素4種抗生素為藥敏材料，分別配制硫酸鏈霉素(1000μg/ml)、磺胺嘧碇鈉(1mg/ml)、青霉素(1000U/ml)、氯霉素(1mg/ml)的PBS液，再分別加入含衣原體的雞胚材料，4℃作用4h，接種雞胚，每株接5個胚，棄去污染雞胚，其余為試驗用雞胚。收集4～6d的死胚涂片檢查,記錄有紅染衣原體顆粒的雞胚與試驗用雞胚的數(shù)量。另每株衣原體各設(shè)一組空白對照，即各株衣原體的組織懸液在4℃放置4h后直接接種雞胚，而不與任何藥物作用，觀察雞胚死亡情況。

(2)碘染試驗 參照文獻[7]方法進行。用分離各衣原體株的雞胚卵黃囊膜涂片、火焰固定，以Lugol氏碘液染色10min，觀察包涵體與背景的顏色。

(3)小雞接種試驗 參照文獻[8]的方法進行。選取8～12g健康小雞18只，分成6組，每組3只，1～5組分別接分離的4株衣原體和標(biāo)準(zhǔn)的鸚鵡熱衣原體的卵黃囊懸液；第6組接健康雞胚的卵黃囊懸液。各組腹腔內(nèi)接種病料懸液1ml/只，觀察雞的發(fā)病情況。接種后1周內(nèi)無異常者，各組剖殺1～2只，取脾、肝制成懸液用雞胚分離。

2 結(jié)果與分析

2.1 衣原體的分離培養(yǎng)

從病料中共分離出4株衣原體，分別編號為y-1、y-2、y-3、y-4。病料在6～8日齡雞胚上連續(xù)繼代3～6代后，可使雞胚于接種后4～7d出現(xiàn)規(guī)律性死亡，并表現(xiàn)出典型的病變特征：胚體充血，出血，雞胚的頭、頸、背部有出血斑；卵黃膜變薄，尿囊液清澈，囊膜水腫。

2.2 染色鏡檢觀察

取少許雞胚卵黃囊制成涂片，自然干燥，甲醇固定，磷酸緩沖液沖洗后，在油鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，有一較大顆粒被染成藍紫色，較小顆粒被染成紫紅色(圖1)。這與標(biāo)準(zhǔn)株(圖2)染色結(jié)果對比相一致。由此可初步表明：分離出來的病株可能是衣原體。

圖1 衣原體分離株染色鏡檢圖

圖2 衣原體標(biāo)準(zhǔn)株染色鏡檢圖

2.3 衣原體的鑒定

表1 各種藥物與衣原體各株懸液作用后接種雞胚情況

2.3.1 藥敏試驗

各種藥物與衣原體懸液作用后接種雞胚，結(jié)果表明，分離衣原體對磺胺嘧啶鈉和鏈霉素不敏感，而對青霉素和氯霉素敏感(表1)。

2.3.2 碘染實驗

將各衣原體株感染的雞胚卵黃囊涂片碘染后，包涵體與背景一樣呈淡褐色，結(jié)果均為陰性，說明這5株衣原體不含糖原。

2.3.3 小雞接種試驗

出于對試驗條件和試驗成本的考慮，試驗用小雞代替小白鼠作材料，進行動物致病性實驗。衣原體各株病料懸液接種小雞后，多數(shù)無明顯癥狀，但試驗組小雞出現(xiàn)厭食、精神萎靡、被毛粗亂等現(xiàn)象，而對照組無異常。6～7d后各試驗組小雞的癥狀均有好轉(zhuǎn)。剖殺后從肝、脾等懸液中分離出了衣原體。由此表明，分離的各衣原體菌株對小雞有不同程度的致病性。

3 結(jié)論與討論

本研究以發(fā)病或沒有發(fā)病豬的糞便作衣原體分離，分離的4株衣原體株經(jīng)過鑒定，其形態(tài)結(jié)構(gòu)符合鸚鵡熱衣原體特征，用姬姆薩氏法染色后，在光學(xué)顯微鏡下可見在淡綠色背景下紅染的針尖大小的衣原體小顆粒。在動物試驗中，4株衣原體都不能致死小雞，但小雞不同程度地表現(xiàn)出了發(fā)病癥狀，并從小雞都再次分離到了病原。藥敏試驗結(jié)果表明，對青霉素、氯霉素敏感，而對磺胺、鏈霉素等不敏感。碘染試驗為陰性。通過以上各種鑒定，證明所分離到的4株衣原體為鸚鵡熱衣原體。

進入21世紀(jì)，人畜共患疾病成為公共衛(wèi)生關(guān)注的熱點。動物衣原體病是由鸚鵡熱衣原體引起的十分重要的自然疫源性疾病。該病人畜共患，呈地方性流行，常造成很大危害及經(jīng)濟損失。已發(fā)現(xiàn)侵染18個目、29個科的190余種鳥類(包括家禽)以及綿羊、山羊、奶牛、牦牛、馬屬動物、豬、狗、貓、猴、兔、豚鼠及小鼠等許多哺乳動物、野生動物和人類，對人類健康是個潛在的威脅，是影響人類公共衛(wèi)生的重要疫病之一[9]。目前對該病的診斷方法較多。實驗室診斷可先采用光學(xué)顯微鏡檢查，其次是采用免疫學(xué)診斷，包括應(yīng)用補體結(jié)合(CF)試驗、間接血凝(IHA)試驗，免疫熒光試驗、瓊脂免疫擴散試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、血凝抑制試驗(HI)，變態(tài)反應(yīng)以及衣原體DNA的純化及檢測技術(shù)等(Grimes J E，Daft B E，Grumbles L C，et al．A manual of methods for laboratory diagnosis of avian chlamydiosis ．Am Assoc Avian Pathol, Kennet t Square，PA，1987．)。

因衣原體病是一種涉及多種家禽、家畜動物、野生動物和人類的自然疫源性疾病，所以在制定防治措施時，要考慮患病畜禽對人感染的威脅，因此在動物飼養(yǎng)場應(yīng)采取以下措施：(1)動物飼養(yǎng)生產(chǎn)區(qū)與職工生活區(qū)要嚴(yán)格分開，場內(nèi)入口處應(yīng)設(shè)有消毒，更衣設(shè)備，嚴(yán)禁非工作人員進場。(2)定期對畜禽進行血清學(xué)檢查，對種公畜定期進行精液檢查。衣原體CF抗體滴度在1∶8以上或在精液中發(fā)現(xiàn)衣原體者必須淘汰。少數(shù)良種公畜采取隔離用四環(huán)素族抗生素治療1～2個療程后，再進行兩次血清學(xué)檢查為陰性，精液無衣原體者可留用。(3)如果場內(nèi)經(jīng)常發(fā)生流產(chǎn)、死胎、肺炎、多關(guān)節(jié)炎、結(jié)膜炎等疾病更應(yīng)注意，要采取隔離和進一步診斷發(fā)病原因，并進行治療。(4)在調(diào)運種畜禽時，在飼料中應(yīng)添加土霉素或氯霉素、紅霉素及多種維生素，減少疫病發(fā)生的機會。

[1]朱其太．衣原體分類新進展[J]．中國獸醫(yī)雜志，2001，(4)：30-31．

[2]盧國棟，郭萬正．豬衣原體病及其防治[J]．湖北畜牧獸醫(yī)，2002，(2)：26-27．

[3]孔繁德，陳信忠，龔艷清,等．從進境大火烈鳥中檢出衣原體病[J]．中國動物檢疫，2001，(11)：39-40．

[4]Calnek B W(高 福，劉文軍，譯)．禽病學(xué)[M]．北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1991．

[5]邱昌慶．禽衣原體病研究進展[J]．畜牧獸醫(yī)科技信息，2002，(8)：12-14．

[6]楊宜生，姜天童．豬衣原體病研究初報[J]．湖北畜牧獸醫(yī)，1982，(2)：2-4．

[7]段躍進．豬衣原體病[J]．中國畜禽傳染病，1991，(1)：62-63．

[8]楊宜生，姜天童．豬衣原體病的病原分離和鑒定[J]．中國獸醫(yī)雜志，1984，(9)：4-6．

[9]劉振江，羅啟慧．動物衣原體病研究現(xiàn)狀[J]．動物醫(yī)學(xué)進展，2004，(2)：29-31.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.03.007

Q93-331

A

1673-1409(2012)03-S024-03

2012-03-07

歐陽金旭(1965-)，男，湖北監(jiān)利人，碩士生，研究員，主要從事獸醫(yī)疫病防控研究。