多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐消毒劑、滅菌劑基因研究

侯明玖(江陵縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 江陵 434100)

曾 明(湖北省臨床檢驗(yàn)中心，湖北 武漢 430064)

侯玲俐，楊宏偉(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院，湖北 十堰 442000)

多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐消毒劑、滅菌劑基因研究

侯明玖(江陵縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 江陵 434100)

曾 明(湖北省臨床檢驗(yàn)中心，湖北 武漢 430064)

侯玲俐，楊宏偉(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院，湖北 十堰 442000)

目的：了解多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌菌株的消毒劑與磺胺類抗菌藥物耐藥相關(guān)基因存在狀況，揭示鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制。方法：瓊脂稀釋法測(cè)定醫(yī)院常用消毒劑的MIC，并用PCR法檢測(cè)I類整合子標(biāo)志物之一的qacE△1-sul1 同時(shí)也是消毒劑耐藥基因。結(jié)果： 20株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)醫(yī)院常用消毒劑苯扎溴銨(新潔爾滅)和二氯異氰尿酸鈉(潔消精)的MIC分別為8～32μg /ml之間，高于對(duì)照菌的MIC； qacE△1-sul1基因陽(yáng)性率100%。結(jié)論： 多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)醫(yī)院常用消毒劑苯扎溴銨和二氯異氰尿酸鈉表現(xiàn)為耐藥；I類整合子標(biāo)志物之一的消毒劑與磺胺類等抗菌藥物耐藥相關(guān)基因(qacE△1-sul1) 攜帶率較高，與消毒劑與復(fù)方新諾明耐藥表現(xiàn)一致，說(shuō)明細(xì)菌攜帶qacE△1-sul1基因是消毒劑、滅菌劑耐藥的主要因素。

鮑曼不動(dòng)桿菌；多重耐藥；耐藥機(jī)制

多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(multi-drug resistant Acinetobacter baumannii, MDRAB)是重要的醫(yī)院內(nèi)感染病原菌之一，可引起院內(nèi)感染的暴發(fā)流行。在醫(yī)院感染控制中消毒劑起著重要的作用[1]，目前各種消毒劑在醫(yī)院應(yīng)用十分廣泛，與其它抗生素一樣，細(xì)菌對(duì)醫(yī)院常用消毒劑的耐藥也越來(lái)越廣泛。國(guó)內(nèi)外不同地區(qū)的學(xué)者近年來(lái)已從MDRAB中均檢測(cè)出攜帶耐消毒劑基因的菌株[2-3]。我們對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌20株對(duì)醫(yī)院常用消毒劑苯扎溴銨(新潔爾滅)和二氯異氰尿酸鈉(潔消精)的耐藥性及其相關(guān)基因(qacE△1-sul1)進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株來(lái)源 2009年度從太和醫(yī)院住院患者的痰、尿液、傷口分泌物等標(biāo)本中分離出的20株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，經(jīng)VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏系統(tǒng)鑒定，并作基因檢測(cè)。質(zhì)控菌株：銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.1.2 儀器 VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏系統(tǒng)(法國(guó)梅里埃公司)，PE700型DNA擴(kuò)增儀(美國(guó)PE公司)，G-BOX ND200凝膠成像儀(美國(guó)基因公司)。

1.2方法

1.2.1 抗菌藥物原液配制 稱取抗菌藥物(抗菌藥物苯扎溴銨(新潔爾滅)和二氯異氰尿酸鈉(潔消精)干粉，按藥典推薦的溶解劑溶解，將藥物分別配制成5120μmol/L的抗菌藥物原液，經(jīng)過(guò)過(guò)濾后，在-20℃冰箱冷藏。根據(jù)以下公式計(jì)算藥物干粉用量[4]：

質(zhì)量(mg)=溶劑(ml)×濃度(mg/ml)/分析效能

1.2.2 含藥M-H瓊脂平板制備 藥物原液，用雙蒸水稀釋，使藥物的終濃度(μg/ml)分別為5120、2560、1280、640、320、160、80、40、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3。稱取M-H干粉38g加入蒸餾水920ml，溶解后，將pH調(diào)整至7.4，在121℃下滅菌15min，冷卻至50℃左右，用量筒量取22.5ml溶液傾注于直徑為9cm的無(wú)菌培養(yǎng)皿，快速加入相相應(yīng)的抗菌藥物稀釋液2.5ml，對(duì)照平板則加入2.5 ml無(wú)菌蒸餾水，就配成含不同濃度藥物的M-H平板，自然冷卻，無(wú)菌試驗(yàn)合格后置2～8℃冰箱冷藏備用[5]。

1.2.3 顯色藥敏 (MIC)測(cè)定 采用瓊脂稀釋法測(cè)定苯扎溴銨(新潔爾滅)和二氯異氰尿酸鈉(潔消精)的MIC。瓊脂稀釋法嚴(yán)格按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)2008版[5]操作。挑取培養(yǎng)好的單個(gè)菌落，用生理鹽水配成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊募?xì)菌懸液，將細(xì)菌懸液與生理鹽水再稀釋10倍，吸取菌液約1～2μl接種于含藥M-H瓊脂平板表面，同時(shí)接種生長(zhǎng)對(duì)照平板。35℃溫箱孵育24h后判斷結(jié)果。判斷界值標(biāo)準(zhǔn)參照CLSI M100-S18[5]進(jìn)行。

1.2.4 耐藥基因檢測(cè) 根據(jù)GenBank公布的耐藥基因序列，用Primer Premier 5.0軟件自行設(shè)計(jì)引物，qacE△1-sul1引物：P1：5′-TAGCGAGGGCTTTACTAAGC；P2：5′-ATTCAGAATGCCGAACACCG。其擴(kuò)增后產(chǎn)物長(zhǎng)度300bp。細(xì)菌DNA提取：雙蒸水法，挑取細(xì)菌加入含250μl無(wú)菌雙蒸水的EP管，沸水浴5min，離心(13000rpm)10min，取上清即為細(xì)菌DNA。

基因擴(kuò)增：PCR法，反應(yīng)體系：Taq酶(5U/μl) 0.2μl，MgCl22μl，dNTP 1.25μl，10×Buffer 2.5μl，引物各1μl，標(biāo)本1μl，ddH2O14.8μl，SYBR 1.25μl，反應(yīng)總體積為25μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min(1個(gè)循環(huán))， 94℃30s、55℃30s 、72℃45s(30個(gè)循環(huán))， 72℃7min(1個(gè)循環(huán))。

基因檢測(cè)：2%瓊脂糖凝膠電泳，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入凝膠的點(diǎn)樣孔，以 DNA Marker作對(duì)照；電壓60V，4.5h電泳。電流后在凝膠成像分析儀上成像(以ATCC25922及空白為陰性對(duì)照)。

2 結(jié) 果

2.1顯色藥敏結(jié)果

20株多重耐藥不動(dòng)桿菌測(cè)定的苯扎溴銨(新潔爾滅)和二氯異氰尿酸鈉(潔消精)MIC結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 苯扎溴銨和二氯異氰尿酸鈉的MIC結(jié)果及基因檢測(cè)結(jié)果

圖1 qacE△1-sul1基因PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2基因檢測(cè)結(jié)果

PCR 產(chǎn)物電泳圖見(jiàn)圖1 。20株多重耐藥不動(dòng)桿菌耐消毒劑基因(qacE△1-sul1) 陽(yáng)性率為100%。

3 討 論

目前鮑曼不動(dòng)桿菌已經(jīng)成為各級(jí)醫(yī)院最難以治療和控制的醫(yī)院感染病原菌之一。在醫(yī)院感染控制過(guò)程中消毒劑應(yīng)用十分廣泛，醫(yī)院感染的各種細(xì)菌在低劑量或亞致死劑量消毒劑的作用下，受到選擇壓力的作用，產(chǎn)生耐藥性。因此細(xì)菌對(duì)各種消毒劑的耐藥現(xiàn)象已經(jīng)成為醫(yī)院感染控制研究的新的領(lǐng)域。國(guó)內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)多種菌株對(duì)消毒劑產(chǎn)生了耐藥性，例如對(duì)雙胍類、酚類、季銨鹽類、醇類、碘等的耐藥性[6-7]。作者對(duì)20株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌菌株對(duì)目前醫(yī)院常用和消毒劑苯扎溴銨和二氯異氰尿酸鈉進(jìn)行了MIC測(cè)定，其MIC均在8～32μg/ml，均高于標(biāo)準(zhǔn)株的4μg/ml和1μg/ml的水平，研究結(jié)果提示對(duì)MDRAB醫(yī)院常用消毒劑苯扎溴銨(新潔爾滅)和二氯異氰尿酸鈉(潔消精)耐藥。細(xì)菌攜帶qacE△1-sul1基因是其對(duì)醫(yī)院常用消毒劑耐藥的主要因素，其中qac基因所編碼的Qac蛋白是膜蛋白型的多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其可介導(dǎo)對(duì)親脂性消毒劑(Quatemary Ammonium Compounds，Qac)外排。如果細(xì)菌獲得這一基因并開(kāi)始表達(dá)則細(xì)菌將雙胍類(如氯已定)、季胺類(如苯扎溴銨) 、堿性染料、腙類化合物等排出細(xì)菌體外。目前已發(fā)現(xiàn)的qac基因家族有A、B、C、D、E、E△1、F、G、H、J等10種，其中由整合子介導(dǎo)的qacE△1基因，廣泛的存在于革蘭陽(yáng)性菌和陰性菌[8-10]。sull基因可編碼二氫葉酸合成酶，這一基因陽(yáng)性則提示細(xì)菌對(duì)磺胺類藥物耐藥。qacE△l基因和sull基因?yàn)橹丿B基因，存在于I類整合子的3′保守端。本文作者在qacE△1下游和sul1上游分別設(shè)計(jì)引物P1、P2，基因擴(kuò)增陽(yáng)性則表示qacE△l和sul1基因同時(shí)存在。I類整合子在整合子介導(dǎo)的細(xì)菌耐藥機(jī)制中起著十分重要的作用，目前用來(lái)檢測(cè)I類整合子最常用且最有效的方法就是用PCR擴(kuò)增方法檢測(cè)Ⅰ類整合子的intI1 和(或) qacE△1標(biāo)志物。我們用PCR法檢測(cè)消毒劑耐藥相關(guān)基因(qacE△1-sul1)，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)20株多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌的相關(guān)基因的陽(yáng)性率為100%。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示本地區(qū)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)目前臨床常用的消毒劑的MIC值均不同程度高于標(biāo)準(zhǔn)菌株，細(xì)菌的耐藥基因檢測(cè)均為陽(yáng)性，說(shuō)明本地區(qū)的MDRAB菌株對(duì)消毒劑產(chǎn)生了耐藥趨勢(shì)，因此醫(yī)院感染控制部門(mén)應(yīng)對(duì)這一現(xiàn)象引起高度關(guān)注。這一結(jié)果還提示醫(yī)院相關(guān)部門(mén)和廣大醫(yī)務(wù)工作者需要高度重視在醫(yī)院內(nèi)規(guī)范使用消毒劑的的問(wèn)題，同時(shí)加強(qiáng)醫(yī)院各項(xiàng)消毒管理制度，提高醫(yī)護(hù)人員對(duì)手衛(wèi)生的重視，防止消毒劑耐藥的菌株的在醫(yī)院內(nèi)的傳播，從而減少醫(yī)院感染的發(fā)生。

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[編輯] 一 凡

R446.5

A

1673-1409(2012)04-R062-03

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2012.04.031

2012-03-02

湖北省十堰市科技攻關(guān)項(xiàng)目(2009S25)

侯明玖(1972-)，男，湖北荊州人，主管技師，主要從事臨床檢驗(yàn)工作；通訊作者：侯玲俐，E-mail：472230556@qq.com。