結(jié)直腸癌中Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)及其表達(dá)研究

劉康兵，楊振平，羅紀(jì)紅 (石首市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，湖北 石首 434400)

結(jié)直腸癌中Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)及其表達(dá)研究

劉康兵，楊振平，羅紀(jì)紅 (石首市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，湖北 石首 434400)

目的：觀察結(jié)直腸癌中Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)及Runx3基因表達(dá)情況，探討Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域異常甲基化狀態(tài)在結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的意義。方法：采用DNA甲基化特異性PCR(MSP)技術(shù)分別對(duì)7種結(jié)直腸癌細(xì)胞系和65例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織及其癌旁組織Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞系及腫瘤組織、癌旁組織中Runx3基因表達(dá)情況。結(jié)果：在結(jié)直腸癌組織中，Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化率占43.1%(28/65)，而在相對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中，Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域未發(fā)現(xiàn)高甲基化現(xiàn)象；在7種結(jié)直腸癌細(xì)胞系中，有6種細(xì)胞Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域存在過(guò)度甲基化異常；RT-PCR結(jié)果顯示，7種結(jié)直腸癌細(xì)胞系中僅Caco-2細(xì)胞中出現(xiàn)Runx3基因表達(dá)，而65例結(jié)直腸癌標(biāo)本中，Runx3 mRNA表達(dá)率為49.2%(32/65)，其表達(dá)情況與腫瘤分化程度、Dukes分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)之間存在顯著相關(guān)性。結(jié)論：Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化是導(dǎo)致Runx3基因失活的主要原因之一，與結(jié)直腸癌發(fā)生密切相關(guān)，可作為結(jié)直腸癌早期診斷的分子標(biāo)記物及分子治療的靶點(diǎn)。

結(jié)直腸癌；Runx3基因；甲基化；表達(dá)

人類Runx3基因位于1號(hào)染色體的1p36.1,基因全長(zhǎng)約67kb,含有p1和p2兩個(gè)啟動(dòng)子、6個(gè)外顯子和1290kb的開(kāi)放閱讀框[1]，其表達(dá)產(chǎn)物約由415個(gè)氨基酸殘基組成，RUNX3蛋白在TGF-β介導(dǎo)的細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分化與凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]，近年來(lái)多種研究發(fā)現(xiàn)Runx3異常表達(dá)與人類多種消化系腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[3]。據(jù)Ku等[4]報(bào)道，結(jié)直腸癌中啟動(dòng)子區(qū)域的高度甲基化是Runx3基因失活的主要機(jī)制，從而導(dǎo)致TGF-β/SMADS信號(hào)通路削弱或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙，影響細(xì)胞分化和凋亡。本研究中我們檢測(cè)了結(jié)直腸癌細(xì)胞系和結(jié)直腸癌組織中Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)和表達(dá)情況，旨在闡明Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化異常與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程的關(guān)系，從而探討Runx3基因可能成為結(jié)直腸癌早期診斷和治療的分子標(biāo)記物。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象

65例結(jié)直腸癌組織及相對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織取自湖北省腫瘤醫(yī)院、荊州市第一人民醫(yī)院和石首市中醫(yī)院腫瘤科2005年8月至2008年5月手術(shù)切除標(biāo)本，所選取的結(jié)直腸癌患者術(shù)前均未實(shí)施放療或化療，患者年齡35～76歲，平均年齡52.8歲，其中男54例，女11例。所取組織離體后立即一分為二，一份先置于液氮中速凍10min,然后置于-80℃冰箱中保存。另一份以40g/L甲醛溶液固定，制作常規(guī)病理切片，通過(guò)HE染色，確定病理診斷。

1.2基因組DNA提取及甲基化PCR(MSP)

利用常規(guī)酚/氯仿抽提法提取DNA,參照MSP方法[5]對(duì)稀釋的DNA進(jìn)行預(yù)處理，兩對(duì)Runx3基因的甲基化引物和非甲基化引物設(shè)計(jì)和PCR反應(yīng)參見(jiàn)文獻(xiàn)[6]。

1.3MSP結(jié)果判斷

在MSP結(jié)果中，僅甲基化引物能擴(kuò)增出目的帶型，表明Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域過(guò)度甲基化；如甲基化引物和非甲基化引物都能擴(kuò)增出目的帶型，表明Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域處于部分甲基化狀態(tài)；僅非甲基化引物能擴(kuò)增出目的帶型，表明Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域未甲基化。

1.4總RNA抽提及RT-PCR

收集細(xì)胞后，總RNA抽提及RT-PCR參見(jiàn)文獻(xiàn)[7]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS11.0軟件對(duì)Runx3 mRNA表達(dá)情況與臨床病理資料之間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)分析不同組別Runx3 mRNA表達(dá)情況。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

M:250bp梯度標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量m:甲基化；u:未甲基化。

2.1Runx3基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞中甲基化狀態(tài)及表達(dá)情況

在7種結(jié)直腸癌細(xì)胞(以胃癌細(xì)胞SNU-1、SNU-5為參照)中，僅Caco-2細(xì)胞中Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)部分甲基化，其余6種結(jié)直腸癌細(xì)胞中Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)都呈現(xiàn)過(guò)度甲基化現(xiàn)象(圖1)。利用RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞Runx3基因表達(dá)情況顯示，僅Caco-2細(xì)胞中出現(xiàn)Runx3基因表達(dá)(圖2)。

2.2Runx3基因在結(jié)直腸癌組織中甲基化狀態(tài)分析

在65例結(jié)直腸癌組織中,Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率約占43.1%(28/65)，其中部分甲基化狀態(tài)占18.5%(12/65)，而在相對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中，Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域未發(fā)現(xiàn)過(guò)度甲基化現(xiàn)象(圖3),兩者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Plt;0.05)。

M:250bp梯度標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量。

M:250bp梯度標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量；m:甲基化；u:未甲基化；N：正常結(jié)直腸組織；T：結(jié)直腸癌組織；

2.3Runx3mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

在65例結(jié)直腸癌標(biāo)本中，Runx3 mRNA表達(dá)率為49.2%(32/65)，不表達(dá)的標(biāo)本約為50.8%(33/65)，且Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)過(guò)甲基化的12例結(jié)直腸癌標(biāo)本中Runx3 mRNA全部不表達(dá)，而在相應(yīng)的癌旁組織中，Runx3 mRNA全部表達(dá)(見(jiàn)表1)。結(jié)直腸癌組織與癌旁組織之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Plt;0.05)。結(jié)直腸癌組織中Runx3 mRNA表達(dá)情況與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、腫瘤組織學(xué)類型等臨床病理參數(shù)無(wú)關(guān)(Pgt;0.05)，而與腫瘤分化程度、Dukes分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)有關(guān)(Plt;0.05)。

3 討 論

癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活是結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，新型抑癌基因Runx3廣泛表達(dá)于消化道上皮細(xì)胞、血液細(xì)胞、間葉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等[8-9]。Runx3基因是Runx家族中最近受到廣泛研究的基因，是哺乳動(dòng)物runt家族進(jìn)化的基礎(chǔ)[10]，其產(chǎn)物通過(guò)指導(dǎo)TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而對(duì)細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡等起著重要的作用。Runx3基因失活或下調(diào)表達(dá)的機(jī)制目前認(rèn)為可能與基因缺失和甲基化相關(guān)[11]，而腫瘤細(xì)胞中Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化是其失活的主要原因[12]。

表1 結(jié)直腸癌組織中Runx3 mRNA表達(dá)情況與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Runx3基因的5'端啟動(dòng)子及附近存在4.2kb的CpG島,其GC含量約高達(dá)64%，這種結(jié)構(gòu)表明該基因可能受甲基化的調(diào)控[9]。許多研究表明，Runx3基因在胃癌、肝細(xì)胞癌、膽道腫瘤、肺癌、嬰兒睪丸內(nèi)胚竇瘤等人類多種腫瘤中存在啟動(dòng)子區(qū)域甲基化異常[1，13-16]，在結(jié)直腸癌中也有報(bào)道[17]，這是抑癌基因Runx3失活的主要機(jī)制。本研究通過(guò)運(yùn)用MSP技術(shù)對(duì)7種結(jié)直腸癌細(xì)胞系和65例結(jié)直腸癌患者癌組織Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況進(jìn)行研究顯示，7種結(jié)直腸癌細(xì)胞中，僅Caco-2細(xì)胞中Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)部分甲基化，其余6種結(jié)直腸癌細(xì)胞中Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)都呈現(xiàn)過(guò)度甲基化現(xiàn)象；65例結(jié)直腸癌組織中Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率約占43.1%(28/65)，其中部分甲基化狀態(tài)占18.5%(12/65)，而在相對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中，Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)域未發(fā)現(xiàn)過(guò)度甲基化現(xiàn)象[18]，兩者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Plt;0.05)。MSP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)過(guò)度甲基化現(xiàn)象是結(jié)直腸癌中常見(jiàn)的表觀遺傳事件，可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。我們通過(guò)RT-PCR方法分析了7種結(jié)直腸癌細(xì)胞系和65例結(jié)直腸癌患者癌組織及癌旁組織中Runx3 mRNA表達(dá)情況。在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中，僅Caco-2細(xì)胞中出現(xiàn)Runx3基因表達(dá)，其表達(dá)結(jié)果與MSP實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符；在65例結(jié)直腸癌組織中，Runx3 mRNA表達(dá)率為49.2%(32/65)，不表達(dá)的標(biāo)本約為50.8%(33/65)，且Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)過(guò)甲基化的12例結(jié)直腸癌標(biāo)本中Runx3 mRNA全部不表達(dá)，而在相應(yīng)的癌旁組織中，Runx3 mRNA全部表達(dá)，結(jié)直腸癌組織與癌旁組織之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Plt;0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌中Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化現(xiàn)象與其mRNA表達(dá)下調(diào)保持一致。通過(guò)研究結(jié)直腸癌組織中Runx3 mRNA表達(dá)情況與臨床病理參數(shù)的關(guān)系顯示，Runx3 mRNA表達(dá)情況與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、腫瘤組織學(xué)類型等臨床病理參數(shù)無(wú)關(guān)(Pgt;0.05)，而與腫瘤分化程度、Dukes分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)之間存在顯著相關(guān)性(Plt;0.05)。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，Runx3基因啟子區(qū)CpG島的高甲基化在結(jié)直腸癌的發(fā)病過(guò)程中是一種常見(jiàn)的表觀遺傳學(xué)事件，而Runx3作為一個(gè)腫瘤抑制基因，其表達(dá)下調(diào)參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展，并可能與結(jié)直腸癌的分化程度、病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究Runx3基因在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用將可作為結(jié)直腸癌早期診斷的分子標(biāo)記物及分子治療的靶點(diǎn)。

[1]張海元，劉娟，解庭波.肝細(xì)胞癌中Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化研究[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2009，38(1)：23-26.

[2]張海元，云鵬.肝癌細(xì)胞系中Runx3基因表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化分析[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)：自科版醫(yī)學(xué)卷，2009，6(1)：1-3.

[3]曾超，賀修勝.Runx3基因與消化系統(tǒng)惡性腫瘤的關(guān)系[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)：腫瘤分冊(cè)，2005，32(2)：128-131.

[4]Ku J L，Kang S B，Shin Y K，et al.Promoter hypermethylation downregulates RUNX3 gene expression in colorectal cancer cell lines[J].Oncogene，2004，23(40)：6736-6742.

[5]James G，Heman，Jeremy R，et al.Methylation-specific PCR：A novel PCR assay for methylation status of CpG islands[J].Proc Natl Acad Sci USA，1996，93：9821-9826.

[6]何小兵.胃癌細(xì)胞系Runx3基因甲基化狀態(tài)及臨床意義[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)：自科版醫(yī)學(xué)卷， 2008，5(4)：16-18.

[7]何小兵，張海元，王衛(wèi)政.胃癌中Runx3基因甲基化表達(dá)及臨床研究[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)：自科版醫(yī)學(xué)卷，2009，6(2)：16-19.

[8]Woolf E，Xiao C，F(xiàn)ainaru O，et al.Runx3 and Runx1 are required for CD8 T cell development during thymopoiesis[J].Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(13)：7731-7736.

[9]Levanon D，Bettoun D，Harris-Cerruti C，et al.The Runx3 transcription factor regulates development and survival of Trk C dorsal root ganglia eurons[J].EMBO J，2002，1(13)：3454-3463.

[10]Bangsow C，Rubins N，Glusman G，et al.The RUNX3 gene sequence structure and regulated expression[J].Gene，2001，279：221-232.

[11]Tozawa T，Tamura G，Honda T，et al.Promoter hypermethy lation of DAP-kinase is associated with poor survival in primary biliary tract carcinoma patients[J].Cancer Sci，2004，95(9) ：736-740.

[12]Kato N，Tamura G，F(xiàn)ukase M，et al.Hypermethylation of the Runx3 gene promoter in testicular yolk sac tumor of infants[J].Am J Pathol，2003，163(2) ：387-391.

[13]Sato K，Tomaizawa Y，Lijima H，et al.Epigenetic inactivation of the RUNX3 gene in lung cancer[J].Oncol Rep，2006，15(1)：129-135.

[14]Tomohiro Tozawa，Gen Tamura，Teiichiro Honda，et al.Promoter hypermethylation of DAP-kinase is associated with poor survival in primary biliary tract carcinoma patients[J].Cancer Sci，2004，95：736-740.

[15]張海元，熊維，任松森.肝細(xì)胞癌中Runx3基因表達(dá)狀態(tài)分析及預(yù)后評(píng)估價(jià)值的研究[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版醫(yī)學(xué)卷，2010，7(3)：15-17.

[16]Noriko Kato，Gen Tamura，Masayuki Fukase，et al.Hypermethylation of the RUNX3 Gene Promoter in Testicular Rolk Sac Tumor of Infants[J].American Journal of Pathology，2003，163：387-391.

[17]Ajay Goel，Takeshi Nagasaka，Christian N，et al.The CpG island methylator phenotype and chromosomal instability are inversely correlated in sporadic colorectal cancer[J].Gastroenterology，2007，132(1)：127-138.

[18]何小兵，張海元.胃癌及癌旁組織中Runx3基因甲基化研究及臨床意義[J].吉林醫(yī)學(xué)，2012，33(2)：227-228.

[編輯]一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2012.03.003

R735.5；R730.231

A

1673-1409(2012)03-R006-04

2012-01-16

湖北省教育廳中青年項(xiàng)目(020091207)

劉康兵(1974-)，男，湖北石首人，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究工作。