LAMP方法快速診斷犬瘟熱感染一例

溫 海 秦海斌 張匯東 賀星亮

LAMP方法快速診斷犬瘟熱感染一例

溫 海 秦海斌 張匯東 賀星亮

犬瘟熱是由犬瘟熱病毒（Distemper virus，CDV）引起的犬科、貓科、鼬科、浣熊科等動物的一種急性、高度接觸性傳染病，可導(dǎo)致犬50%～100%的發(fā)病率和60%～90%病死率，康復(fù)犬典型后遺癥是犬嗅覺功能下降或喪失。我國1972年首次報道本病在犬流行，并陸續(xù)在貉、貂、狐、大小熊貓、猴等動物中發(fā)現(xiàn)本病。自20世紀(jì)80年代以來，隨著我國警、軍犬工作的發(fā)展及伴侶動物的增多，使人們對本病及病原有了高度的重視。

近幾年，眾多非典型犬瘟熱臨床病例的出現(xiàn)使得犬瘟熱臨床癥狀越來越復(fù)雜，僅根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀、包涵體檢查和病毒分離等常規(guī)方法很難確診CDV感染，國內(nèi)外許多學(xué)者對CDV診斷進行了大量研究，建立了RTPCR、巢式PCR、套式PCR、原位雜交、原位雜交與RT-PCR結(jié)合等多種分子生物學(xué)檢測方法，這些分子生物學(xué)技術(shù)從CDV的 RNA入手，通過基因水平來鑒定病毒的存在，具有高度的敏感性、特異性、可信度高等優(yōu)點，但其反應(yīng)擴增過程、結(jié)果判斷環(huán)節(jié)上均要求具備先進的儀器設(shè)備，因而在臨床檢測中的應(yīng)用受到限制，因此，讓這些技術(shù)走出實驗室、滿足獸醫(yī)臨床應(yīng)用一直是相關(guān)研究的焦點。

2000年，日本Eiken化工有限公司Notomi T等開發(fā)了一種新的核酸擴增技術(shù)—環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP），在恒溫條件（約60℃～65℃）下通過一步反應(yīng)既能完成靶基因的擴增，若在反應(yīng)產(chǎn)物中加入一種熒光染料，通過反應(yīng)產(chǎn)物的顏色變化即可判斷是否出現(xiàn)了目的基因的擴增，這些特點使該技術(shù)減少了對先進儀器的依賴；同時LAMP技術(shù)大大提高了核酸擴增的效率、減少了擴增時間、簡化了擴增條件，能夠在15min～60min內(nèi)將DNA擴增109倍～1010倍，成為一種具有臨床應(yīng)用前景的診斷方法。筆者所在實驗室利用LAMP技術(shù)建立了犬瘟熱病毒的快速診斷方法，并將其與普通PCR方法的臨床診斷效果進行了對比?，F(xiàn)以一例犬非典型犬瘟熱感染的診斷為例，說明該方法在犬疫病防控中的有效性和可操作性。

一、發(fā)病及臨床癥狀

某犬場一窩德國牧羊犬，5頭38日仔犬齡全部發(fā)病，未接種疫苗，精神沉郁，鼻鏡干燥，其中3頭體溫高于41℃、另2頭39℃，眼瞼均有少量分泌物，鼻流清涕，發(fā)病1天后出現(xiàn)輕微嘔吐、腹瀉，3頭后期嘔吐、腹瀉漸重直至死亡。病程中均未呈現(xiàn)出典型犬瘟熱的膿鼻、鼻鏡干燥、足墊角質(zhì)化、雙相熱及神經(jīng)癥狀。臨床診斷為疑似非典型犬瘟熱，選擇兩頭癥狀較為明顯的病犬分別采集眼分泌物、鼻液、血液共6個樣本，3頭死亡犬采集肺臟進行實驗室診斷。紙條、RT-PCR、LAMP對比診斷結(jié)果見表1。

表1 不同臨床樣本三種檢測方法的效果比較

二、診斷

以犬瘟熱病毒免疫膠體金診斷試紙條、RT-PCR、LAMP技術(shù)3種方法對采集的臨場樣本進行對比檢測，比較3種方法的檢測效果。結(jié)果如下：以進口膠體金試診斷紙條進行現(xiàn)場檢測，眼鼻分泌物中犬瘟熱診斷結(jié)果均為陰性，2個血液樣本犬瘟熱診斷陽性，肺臟樣品未診斷；以進口試劑盒提取RNA，進行CDV病毒的RT-PCR檢測，眼鼻分泌物中未檢測出CDV病毒基因，血液、肺臟樣品CDV病毒基因陽性；以RT-PCR檢測中提取的RNA模板，進行LAMP診斷，除2個鼻液樣本中未檢測出CDV病毒外，其他樣本均呈現(xiàn)LAMP陽性結(jié)果。膠體金試

對比上述診斷結(jié)果可知，3種檢測方法均可有效檢出犬瘟熱病毒的存在，但是基于不同樣本中病毒含量的不同，3種檢測方法呈現(xiàn)出了不同的敏感性，以LAMP方法的敏感性和檢出率最高，RTPCR方法次之，膠體金的靈敏度和檢出率最低。證明LAMP方法在臨床檢測中具備敏感性優(yōu)勢。

另外，與RT-PCR方法比較，LAMP技術(shù)的優(yōu)勢在于其結(jié)果的可視化，PCR方法只能依靠瓊脂糖凝膠電泳進行最后結(jié)果的判斷，受儀器的局限性大；而LAMP技術(shù)除了傳統(tǒng)的瓊脂糖電泳外（圖1），也可通過添加SYBR GreenI、鈣黃綠素等染料進行染色，來檢測擴增是否發(fā)生，在LAMP擴增產(chǎn)物中加入SYBR GreenI，由于SYBR Green I與長度不同莖環(huán)DNA結(jié)合，陽性產(chǎn)物在自然光下由橙色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色，不需要借助儀器即可進行結(jié)果的判斷，見圖2。因此，LAMP方法在臨床檢測中又兼具了操作上的優(yōu)勢。

三、治療

依據(jù)實驗室的確診結(jié)果，以單克隆抗體抗病毒治療為主，輔助結(jié)合平衡、消炎療法。（一）生理鹽水250ml/d，1次/d。（二）犬瘟熱單克隆抗體2 ml/d，1次/d。（三）頭孢拉定250 mg/d，維生素C 200 mg/d，地塞米松0.5 mg/d，連繼治療5d。結(jié)果3頭犬治療不愈死亡，2頭犬癥狀逐漸減輕直至痊愈。

四、討論

早發(fā)現(xiàn)、早確診，對于犬瘟熱后期治療和病情轉(zhuǎn)歸極為關(guān)鍵，尤其在近幾年非典型犬瘟熱發(fā)病比例逐漸增多的情況下，診斷技術(shù)的靈敏性和操作便捷性對獸醫(yī)臨床極為重要。眾多研究表明LAMP技術(shù)操作相對簡便、擴增效率高、靈敏度高（可達常規(guī)PCR的100倍），可進行電泳分析或者加入特定染料觀察染色后觀察顏色變化來定性檢測，這些特點說明LAMP技術(shù)作為一種新型的核酸檢測技術(shù)，可廣范應(yīng)用于犬的病毒、細(xì)菌和寄生蟲等病原微生物的定性檢測。

本文以一例非典型犬瘟熱的比較診斷作為范例，展示了LAMP技術(shù)在犬瘟熱病毒早期診斷中的靈敏性和有效性，為獸醫(yī)臨床診斷提供了一種新方法，但目前而言，LAMP技術(shù)的全部操作過程并未完全擺脫儀器設(shè)備的束縛，尤其在核酸提取環(huán)節(jié)仍需要具備一定實驗儀器和技術(shù)水平，但它在靈敏度、便捷性上的改進，將有望推動和加快核酸擴增技術(shù)應(yīng)用于現(xiàn)場檢測的步伐。另外，LAMP技術(shù)也存在一定的缺陷，比如引物設(shè)計要求較高、存在一定比例的假陽性結(jié)果，但這些問題并非不可解決，隨著該技術(shù)的不斷完善和優(yōu)化，LAMP技術(shù)在動物疫病檢測領(lǐng)域必將會發(fā)揮更大的作用。

（作者單位：公安部南京警犬研究所，210012）

（編輯：李 冰）