下調(diào)X連鎖調(diào)亡抑制蛋白基因表達(dá)增強(qiáng)多西他賽誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡的作用*

盧 瑜， 方 勇

(1南京軍區(qū)杭州療養(yǎng)院，浙江 杭州 310007；2浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，浙江 杭州 310016)

1000-4718(2012)03-0427-06

2011-10-15

2011-12-14

浙江省中醫(yī)藥青年基金資助項(xiàng)目(No.2005-A-12)

△通訊作者 Tel:0571-86006926 ;E-mail：fyzju@sina.com

下調(diào)X連鎖調(diào)亡抑制蛋白基因表達(dá)增強(qiáng)多西他賽誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡的作用*

盧 瑜1， 方 勇2△

(1南京軍區(qū)杭州療養(yǎng)院，浙江 杭州 310007；2浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，浙江 杭州 310016)

目的觀察人源性膀胱癌細(xì)胞在下調(diào)X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)基因表達(dá)后，多西他賽對(duì)其敏感性的影響。方法以shRNA和shRNA-XIAP質(zhì)粒分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人源性膀胱癌T24T細(xì)胞。以熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞。以RT-PCR和Western blotting法分別檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞XIAP mRNA和蛋白的表達(dá)。與T24T以及轉(zhuǎn)染空載體的T24T細(xì)胞相比較，以ATPase法檢測(cè)多西他賽對(duì)轉(zhuǎn)染XIAP基因的膀胱癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性。相差顯微鏡下觀察,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)多西他賽預(yù)處理轉(zhuǎn)染XIAP基因的膀胱癌細(xì)胞的凋亡率；以Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)和caspase-3蛋白表達(dá)和裂解水平。結(jié)果熒光顯微鏡下分別觀察shRNA和shRNA-XIAP轉(zhuǎn)染的T24T細(xì)胞，均見穩(wěn)定熒光。Western blotting和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，人源性膀胱癌T24T細(xì)胞在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染反義XIAP基因后，其XIAP蛋白和mRNA水平均顯著降低。經(jīng)多西他賽處理24 h后, 轉(zhuǎn)染反義XIAP基因的T24T細(xì)胞IC50為(1.23±0.62)nmol/L，遠(yuǎn)低于T24T以及轉(zhuǎn)染空白載體的對(duì)照組細(xì)胞[(8.22±1.23) nmol/L，(8.35±0.98) nmol/L，P<0.01]。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示， T24T shRNA-XIAP細(xì)胞組(2 nmol/L和5 nmol/L)凋亡率[(41.45±6.23)%和(74.82±5.46)%]顯著高于轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞的凋亡率[(25.34±3.81)%和(34.14±6.25)%，P<0.01]。與轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞相比較，T24T shRNA-XIAP細(xì)胞內(nèi)的PARP和caspase-3明顯降低。結(jié)論下調(diào)膀胱癌細(xì)胞的XIAP基因表達(dá)后，可顯著增強(qiáng)化療藥物多西他賽所誘導(dǎo)的膀胱癌細(xì)胞的凋亡，并增強(qiáng)多西化賽的細(xì)胞毒性。

T24T細(xì)胞； X連鎖凋亡抑制蛋白； 多西他賽； 細(xì)胞凋亡

世界范圍內(nèi)，膀胱癌發(fā)病率居惡性腫瘤的第9位，男性排名第6位，女性排在第10位之后[1]。中國(guó)男性膀胱癌發(fā)病率位居全身腫瘤的第8位，女性排在第12位以后。但近年來(lái)我國(guó)部分城市腫瘤發(fā)病率報(bào)告顯示膀胱癌發(fā)病率有增高趨勢(shì)。

大部分膀胱癌患者確診時(shí)處于分化良好或中等分化的非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，但其中約25%的患者最終可發(fā)展為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌或轉(zhuǎn)移性膀胱癌[2]?；颊叱霈F(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶后，需要接受化放療治療。患者常接受包括多西他賽(docetaxel)在內(nèi)的二線藥物治療方案[3]。但由于腫瘤細(xì)胞易對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐受性, 藥物治療常達(dá)不到滿意的療效。

X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)存在的一種抑制凋亡蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs),能直接和caspases家族成員中介導(dǎo)蛋白酶級(jí)聯(lián)下游效應(yīng)分子caspase-3、caspase-7和caspase-9結(jié)合并抑制其活性, 并可抑制化療藥物、紫外線照射、Bax誘導(dǎo)的凋亡[4]。有研究顯示, 腫瘤細(xì)胞中XIAP水平的升高是腫瘤細(xì)胞逃避化療藥物殺傷作用的原因之一[5]。近些年， XIAP在腫瘤化療敏感性中的作用及價(jià)值受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者越來(lái)越多的重視。并在多種腫瘤中，如在胃癌、肺癌、胰腺癌和肝癌細(xì)胞系中均證明下調(diào)XIAP蛋白水平，可提高腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性。在本研究中，我們以shRNA技術(shù)沉默XIAP基因，觀察多西他賽藥物誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性和凋亡效應(yīng)的影響, 以探索改進(jìn)膀胱癌化療療效的新方法。

材 料 和 方 法

1材料

真核表達(dá)載體shRNA-XIAP和空白載體購(gòu)自O(shè)pen Biosystem(載體包含GFP熒光顯色)。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM購(gòu)自Invitrogen。XIAP、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase, PARP]、caspase-3和GAPDH抗體均購(gòu)自Santa Cruz。新生牛血清、DMEM、TRIzol? Reagent Kit和嘌吟霉素(puromycin)購(gòu)自Gibco。 二甲基亞砜(DMSO)和ATP生物熒光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega。多西他賽為法國(guó)賽諾菲-安萬(wàn)特制藥廠產(chǎn)品。高表達(dá)XIAP基因的人源性膀胱癌細(xì)胞T24T購(gòu)自ATCC,細(xì)胞在含有10%新生牛血清、100 kU/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的 DMEM/F12培養(yǎng)基、37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng), 每3 d/傳代1次。

2方法

2.1分組 轉(zhuǎn)染細(xì)胞設(shè)置未轉(zhuǎn)染對(duì)照組、shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和shRNA-XIAP融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。基因轉(zhuǎn)染步驟參照LipofectamineTM試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，分別在轉(zhuǎn)染后24、48 和72 h于熒光倒置顯微鏡下觀察GFP熒光。轉(zhuǎn)染72 h后, 加入嘌呤霉素篩選4周，終濃度5 mg/L?？寺〖?xì)胞形成后, 隨機(jī)挑選克隆,擴(kuò)增抗性細(xì)胞, 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)GFP表達(dá)熒光。

2.2T24T細(xì)胞XIAP mRNA和蛋白表達(dá)的檢測(cè) 收集細(xì)胞約1×106, 按TRIzol?試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，采用Invitrogen公司RT-PCR試劑盒。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系: 模板RNA 2 μg, 10 mmol/L dNTP 1 μL, RNA酶抑制劑(RNasin)1 μL,Oligo dT 1.5 μL, AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL, 5×逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液5 μL, 終體積為25 μL, 50 ℃ 50 min， 采用Pub Mediline的Primer Blast軟件設(shè)計(jì)XIAP基因PCR引物(擴(kuò)增產(chǎn)物大小281 bp),上游引物5’-TTTCCAGATTGGGGCTCGGG-3’,下游引物5’-CCCTGCTCGTGCCAGTGTTGAT-3’,由上海捷倍思基因技術(shù)有限公司合成。同時(shí)以GADPH作為內(nèi)參照。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳， MGIAS-1000凝膠成像系統(tǒng)掃描定量并拍照。采用Western blotting法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株XIAP蛋白表達(dá)情況。即胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗2次，加入蛋白提取液提取細(xì)胞總蛋白。Bio-Rad DC蛋白定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。8%和12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離80 μg細(xì)胞總蛋白后，轉(zhuǎn)至PVDF膜(Bio-Rad)；常規(guī)封閉過(guò)夜，室溫下與抗人XIAP、GAPDH抗體(1∶1 000，Santa Cruz)孵育2 h，與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶7 500, ImmunoResearch)孵育1 h。每次孵育后，均用含0.02% Tween 20的PBS洗脫3次，用ECL(Amersham)系統(tǒng)檢測(cè)信號(hào)。

2.3ATP生物熒光檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞毒性 將T24T、轉(zhuǎn)染空載體T24T shRNA以及T24T shRNA-XIAP細(xì)胞，以5 000 cells/well的密度接種于96孔培養(yǎng)板, 設(shè)置不加藥物陰性對(duì)照，不同濃度的多西他賽藥物與細(xì)胞共同作用48 h。使用Promega公司熒光酶試劑盒(LOT# 154590)，去掉上清后，加入熒光酶底物后，熒光掃描儀(Microplate Luminometer LB 96 V)測(cè)定熒光強(qiáng)度，軟件分析藥物各濃度抑制率，計(jì)算IC50，并繪制藥物作用曲線，評(píng)估藥物作用。

2.4PI 染色法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 胰酶消化并收集細(xì)胞，70%乙醇固定，4 ℃保存。600×g離心5 min，并用PBS液 (含有0.5% BSA 和0.1% Triton X-100)洗2次。加入PI染色液避光保存30 min后，用流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)檢測(cè)DNA含量和凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

2018年12月11日，唐納森無(wú)錫新工廠奠基儀式在華平（無(wú)錫）智造園成功舉行。無(wú)錫新吳區(qū)領(lǐng)導(dǎo)及區(qū)黨政辦、宣傳部、經(jīng)發(fā)局等各部門負(fù)責(zé)人、星洲股份公司負(fù)責(zé)人、唐納森公司董事長(zhǎng)兼首席執(zhí)行官Tod Carpenter先生、亞太區(qū)副總裁Franklin Cardenas先生、大中華區(qū)總裁畢明先生以及唐納森的重點(diǎn)客戶和供應(yīng)商代表一同出席了奠基儀式。

2.5Western blotting檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PARP和caspase-3蛋白裂解 蛋白轉(zhuǎn)膜后，室溫下與抗人PARP、caspace-3、GAPDH抗體孵育2 h,與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶7 500, ImmunoResearch)孵育1 h。每次孵育后，均用含0.02% Tween 20的PBS洗脫3次，用ECL(Amersham)系統(tǒng)檢測(cè)信號(hào)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1shRNA-XIAP轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞后下調(diào)XIAP表達(dá)水平

將shRNA載體和shRNA-XIAP分別轉(zhuǎn)染到T24T細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選4周后，可見明顯的陽(yáng)性克隆, 繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng), 分別獲得穩(wěn)定表達(dá)shRNA-XIAP和空白載體shRNA的T24T細(xì)胞。經(jīng)熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染后的T24T細(xì)胞內(nèi)均出現(xiàn)穩(wěn)定的GFP綠色熒光,見圖1。

Figure 1. T24T cells were stably transfected with shRNA and shRNA-XIAP plasmids, and puromycin was used as drug selection to acquire the stable expression cells. The GFP green fluorescence appeared in the cytoplasm under the fluorescence microscope (×400).

圖1shRNA載體和shRNA-XIAP分別轉(zhuǎn)染到T24T細(xì)胞后GFP的表達(dá)

轉(zhuǎn)染shRNA和shRNA-XIAP的細(xì)胞經(jīng)Western blotting檢測(cè)均可見分子量為55 kD的蛋白條帶,見圖2A。經(jīng)RT-PCR檢測(cè)T24T細(xì)胞均可見281 bp的XIAP擴(kuò)增條帶, 但T24T shRNA-XIAP細(xì)胞以同量的RNA模板擴(kuò)增后僅有微弱的顯影,見圖2B。經(jīng)圖形分析軟件掃描檢測(cè)，以GADPH為內(nèi)參照，T24T shRNA-XIAP組的XIAP蛋白表達(dá)較對(duì)照組T24T shRNA細(xì)胞明顯減低,見圖2C。以上結(jié)果表明轉(zhuǎn)染shRNA-XIAP后，XIAP蛋白和mRNA水平均下調(diào)。

圖2轉(zhuǎn)染shRNA-XIAP和shRNA的T24T細(xì)胞XIAP蛋白和mRNA的表達(dá)

2下調(diào)XIAP表達(dá)后增強(qiáng)多西他賽藥物的細(xì)胞毒性

實(shí)驗(yàn)分未轉(zhuǎn)染對(duì)照組、shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、shRNA-XIAP融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。不同濃度的多西他賽作用細(xì)胞48 h后,檢測(cè)細(xì)胞的ATPase活力,見圖3。T24T細(xì)胞和shRNA T24T細(xì)胞之間的生長(zhǎng)抑制率無(wú)顯著區(qū)別，其IC50分別為(8.22±1.23)nmol/L和(8.35±0.98) nmol/L。而shRNA-XIAP T24T細(xì)胞的IC50為(1.23±0.62)nmol/L，其細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率較其余2組有顯著差異(P<0.01)。

圖3不同濃度的多西他賽分別預(yù)處理未轉(zhuǎn)染對(duì)照組、shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和shRNA-XIAP融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組T24T細(xì)胞48h后細(xì)胞的ATPase活性

與shRNA T24T細(xì)胞相比較，shRNA-XIAP T24T細(xì)胞經(jīng)2.5 nmol/L和5nmol/L多西他賽處理后，出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，如體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮等現(xiàn)象，而細(xì)胞的增殖也受到抑制,見圖4A。T24T shRNA-XIAP細(xì)胞組2nmol/L和5nmol/L多西他賽誘導(dǎo)的凋亡率分別為(41.45±6.23)%和(74.82±5.46)%, 顯著高于轉(zhuǎn)染對(duì)照空載體細(xì)胞的凋亡率[(25.34±3.81)%和(34.14±6.25)%],P<0.01,見圖4B。

4下調(diào)XIAP基因表達(dá)后促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)PARP和caspase-3蛋白的裂解

T24T shRNA-XIAP細(xì)胞的XIAP蛋白表達(dá)較T24T shRNA細(xì)胞明顯下調(diào)。與T24T shRNA細(xì)胞相比較，T24T shRNA-XIAP細(xì)胞經(jīng)2.5 nmol/L和5 nmol/L多西他賽處理后，較明顯地出現(xiàn)了PARP和caspase-3的裂解產(chǎn)物——有活性的17 kD (p17)亞單位，見圖5。證實(shí)下調(diào)XIAP基因可顯著地增加細(xì)胞內(nèi)PARP和caspase-3蛋白發(fā)生裂解，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

討 論

泌尿系統(tǒng)來(lái)源的膀胱上皮腫瘤是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，近年來(lái)發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì), 其晚期接受進(jìn)一步化放療的治療效果仍不理想[2,6]。 本研究證實(shí)，通過(guò)下調(diào)膀胱癌細(xì)胞內(nèi)的XIAP基因，將有助于增加化療藥物如多西他賽的細(xì)胞毒性，促進(jìn)caspase-3裂解，膀胱癌細(xì)胞凋亡明顯增多，有助于提高臨床療效。同時(shí)也表明在多西他賽誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中，XIAP起著重要作用。

越來(lái)越多的研究表明，有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的重要作用機(jī)制。對(duì)細(xì)胞凋亡的抗性是腫瘤細(xì)胞耐藥性產(chǎn)生的新機(jī)制, 可以解釋相當(dāng)一部分化療失敗的原因[7]。IAPs是細(xì)胞內(nèi)一類獨(dú)特的抗凋亡蛋白家族, 包括XIAP、cIAP1、cIAP2、神經(jīng)元凋亡抑制蛋白(neuronal apoptosis inhibitory protein，NAIP)、livin和survivin等。XIAP分子量57 kD，其基因定位于Xq25,主要由3個(gè)桿狀病毒IAP重復(fù)序列區(qū)(baculoviral inhibitor of apoptosis repeat，BIR)和1個(gè)RING鋅指結(jié)構(gòu)域(ring Zn finger domain)組成。XIAP的N-端有3個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域：BIR1、BIR2和BIR3[8]。體外動(dòng)力學(xué)研究表明, XIAP是IAP家族里最強(qiáng)有力的caspase抑制物。XIAP的BIR2及BIR2前的連接區(qū)參與抑制caspase-3和caspase-7的活性, 單獨(dú)的BIR3結(jié)構(gòu)域也足以能夠抑制caspase-9的活性, 這表明XIAP的不同BIR是以不同的方式抑制caspase-3和caspase-9的活性[9]。

已經(jīng)有研究證實(shí), 過(guò)表達(dá)XIAP可抑制凋亡, 提示XIAP可作為腫瘤等疾病基因治療的新靶點(diǎn)。本研究的結(jié)果也證實(shí)，通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)的XIAP表達(dá)，多西他賽誘導(dǎo)的caspase-3裂解明顯增加，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。如He等[10]證實(shí)通過(guò)HtrA1(屬于絲氨酸蛋白酶家族)促進(jìn)卵巢腫瘤細(xì)胞的XIAP降解，可提高順鉑所誘導(dǎo)的卵巢腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。轉(zhuǎn)導(dǎo)反義XIAP不僅使卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性增加, 而且還激活了caspase介導(dǎo)的鼠雙微粒體-2(murine double minute-2，MDM2)活化和p53的積聚[11]。另外在血液系統(tǒng)疾病中，對(duì)78名急性髓系白血病患者的研究發(fā)現(xiàn), XIAP和患者存活率有直接相關(guān)性, XIAP低水平的患者比XIAP高水平者的存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)[12]。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)XIAP可影響化療藥物的敏感性，并影響患者的預(yù)后。

汪良等[13]報(bào)道細(xì)胞在轉(zhuǎn)染XIAP基因并使其過(guò)表達(dá)后，可導(dǎo)致其對(duì)化療藥物絲裂霉素的敏感性下降。另外，陰振飛等[14]證明化療藥物可下調(diào)膀胱癌細(xì)胞XIAP的表達(dá)。我們的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)shRNA技術(shù)轉(zhuǎn)染并下調(diào)人源性膀胱癌細(xì)胞內(nèi)的XIAP基因的表達(dá)，證實(shí)能顯著增降低多西他賽藥物的IC50，誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，促進(jìn)細(xì)胞體內(nèi)的PARP和原caspase-3的裂解, 與文獻(xiàn)報(bào)道的XIAP作用機(jī)制相符合。其結(jié)果與已有在膀胱癌中的上述研究結(jié)果相吻合。這一結(jié)果為提高膀胱癌患者化療敏感性提供新的思路, 也為進(jìn)一步研究XIAP基因在誘導(dǎo)實(shí)體腫瘤細(xì)胞凋亡及凋亡調(diào)控途徑中的作用奠定了基礎(chǔ)。

Figure 4. Apoptosis of T24T shRNA and T24T shRNA-XIAP cells treated with different concentrations of docetaxel for 24 h. A: observation under phase-contrast microscope (×400). B: flow cytometry detection.

圖4不同濃度的多西他賽預(yù)處理對(duì)shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和shRNA-XIAP融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組T24T細(xì)胞凋亡的影響

圖5T24TshRNA和T24TshRNA-XIAP細(xì)胞接受2.5nmol/L和5nmol/L多西他賽24h后PARP和caspase-3蛋白的裂解情況

同時(shí)本研究也還有不足之處。臨床上多西他賽一般是晚期膀胱癌患者的二線藥物方案，多數(shù)病人此前已接受一線含鉑方案的化療。本實(shí)驗(yàn)中直接使用多西他賽，與臨床有一定距離。因此，轉(zhuǎn)染XIAP基因至腫瘤細(xì)胞后，其它含鉑類化療藥物對(duì)細(xì)胞毒性的影響還需要在今后的研究工作中得到進(jìn)一步證實(shí)。細(xì)胞內(nèi)其它信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑如JNK/c-Jun和JAK/STAT的變化也有待進(jìn)一步研究。

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Effectsofdown-regulationofX-linkedinhibitorofapoptosisproteingeneondocetaxel-inducedapoptosisinbladdercancercells

LU Yu1, FANG Yong2

(1HangzhouSanatoriumofNanjingMilitaryRegion,Hangzhou310007,China;2DepartmentofMedicalOncology,SirRunRunShawHospital,SchoolofMedicine,ZhejiangUniversity,Hangzhou310016,China.E-mail:fyzju@sina.com)

AIM: To observe the effects of down-regulation of X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) gene on the chemotherapeutic sensitivity of bladder cancer cells.METHODSThe shRNA and shRNA-XIAP were transfected into bladder cancer T24T cells. The fluorescence microscopy was used to detect the transfection effects.XIAPgene expression was detected by RT-PCR and Western blotting. Docetaxel was administrated to T24T, T24T shRNA and T24T shRNA-XIAP bladder cancer cells. ATPase methods was performed to measureinvitrocell viability. Morphological changes and apoptotic rates were determined by phase contrast microscopy and flow cytometry assay. Cellular poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) and caspase-3 protein expression and their cleavage were assayed by Western blotting.RESULTSThe fluorescence was obvious in the T24T shRNA and T24T shRNA-XIAP cells under the fluorescence microscope. Using Western blotting and RT-PCR methods, the protein and mRNA levels ofXIAPgene in T24T shRNA-XIAP cells were significantly decreased,respectively. After treated with various concentrations of docetaxel for 24 h, the IC50of T24T shRNA-XIAP cells was (1.23±0.62) nmol/L, lower than that of T24T and T24T shRNA cells, which were (8.22±1.23) and (8.35±0.98) nmol/L (P<0.01), respectively. Compared with control group, the typical morphological changes of apoptosis were observed in T24T shRNA-XIAP cells. Detected by flow cytometry assay, the apoptotic rates in shRNA-XIAP group were (41.45±6.23)% and (74.82±5.46)% after exposed to docetaxel at the concentrations of 2 nmol/L and 5 nmol/L for 24 h, which were significantly higher than that in T24T shRNA group with (25.34±3.81)% and (34.14±6.25)%, respectively (P<0.01). Compared with T24T shRNA cells, the cleavage of PARP and caspase-3 proteins in the cells transfected with shRNA-XIAP was significantly increased.CONCLUSIONXIAPgene is significantly down-regulated via shRNA-XIAP, which could increase the docetaxel-induced apoptosis and cytotoxic activity.

T24T cells; X-linked inhibitor of apoptosis protein; Docetaxel; Apoptosis

R73

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.008