抗病毒分散片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

肖 飛，陳 樺，李其鳳，馮柏康

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技產(chǎn)業(yè)園有限公司，廣東 廣州 510445)

抗病毒分散片由連翹、板藍(lán)根、石膏、知母、石菖蒲、廣藿香等中藥加輔料組成，具有清熱祛濕、涼血解毒之功效，主治風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱及上呼吸道感染、流行性感冒、腮腺炎等病毒感染性疾病[1]。本試驗(yàn)在抗病毒分散片優(yōu)選制備工藝基礎(chǔ)上，進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量控制方法研究，建立了連翹、板藍(lán)根、知母、石菖蒲薄層色譜鑒別方法，并用高效液相色譜法測(cè)定連翹苷的含量。該方法結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便，可作為抗病毒分散片的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

Waters 2695-2996型高效液相色譜系統(tǒng)，包括2695溶劑處理系統(tǒng)、2996二極管陣列檢測(cè)器、Empower色譜處理系統(tǒng)，(美國(guó)Waters公司);BP221S型電子天平(d=0.1 mg)，M215S型電子天平(d=0.01 mg)，均為德國(guó)Sartorius公司產(chǎn)品?？共《痉稚⑵瑸閺V州中醫(yī)藥大學(xué)科技產(chǎn)業(yè)園有限公司自制;連翹苷對(duì)照品(批號(hào)為11082200406)、菝葜皂苷元對(duì)照品(批號(hào)為0744-200005)、連翹對(duì)照藥材(批號(hào)為120908-200305)、板藍(lán)根對(duì)照藥材(批號(hào)為121177-200305)、知母對(duì)照藥材(批號(hào)為121070-200306)、石菖蒲對(duì)照藥材(批號(hào)為121098-200402)，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;陰性樣品(自制);乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜(TLC)鑒別

連翹[2-3]:取本品適量，研細(xì)，稱(chēng)取4 g，加水30 mL，加熱回流30 min，濾過(guò)，濾液用乙酸乙酯充分振搖提取3次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液;另取缺連翹的陰性對(duì)照品4 g，同法制成陰性對(duì)照品溶液;再取連翹對(duì)照藥材2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國(guó)藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯(9∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，100℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液無(wú)干擾(圖1 A)。

板藍(lán)根[4-5]:取本品適量，研細(xì)，取3 g，加水50 mL，加熱回流30min，離心，取上清液置分液漏斗中，用乙醚提取2次，每次30mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴?.5 mL使溶解，作為供試品溶液;另取缺板藍(lán)根的陰性對(duì)照品3 g，同法制成陰性對(duì)照品溶液;再取板藍(lán)根對(duì)照藥材2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國(guó)藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠GF254薄層板上，以苯-三氯甲烷-丙酮(5∶4∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液無(wú)干擾(圖1 B)。

知母[6]:取本品適量，研細(xì)，稱(chēng)取6 g，加水50 mL，加熱回流30 min，放冷，濾過(guò)，濾液用水飽和的正丁醇提取2次，每次40 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)右掖?0 mL，鹽酸1 mL，加熱回流1 h后濃縮至約5 mL，再加水10 mL，用石油醚(60～90℃)30 mL振搖提取，石油醚提取液用0.5%氫氧化鈉溶液20 mL洗滌，棄去堿液，再用水20 mL洗滌，棄去水液，石油醚液蒸干，殘?jiān)右掖?.5 mL使溶解，作為供試品溶液;另取缺知母的陰性對(duì)照品6 g，同法制成陰性對(duì)照品溶液;再取知母對(duì)照藥材2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液;取菝葜皂苷元對(duì)照品，加無(wú)水乙醇制成每1 mL含3 mg的溶液作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國(guó)藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以苯-丙酮(19∶2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以8%香草醛無(wú)水乙醇溶液和硫酸溶液(7→10)的混合溶液(0.5∶5)，100℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液和對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液無(wú)干擾(圖1 C)。

石菖蒲[6-7]:取本品20片，粉碎過(guò)40目篩，加水50 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液用石油醚(30～60℃)提取2次，每次50 mL，提取液水浴蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液;另取缺石菖蒲的陰性對(duì)照品12 g，同法制成陰性對(duì)照品溶液;再取石菖蒲對(duì)照藥材1 g，加石油醚(30～60℃)50 mL，超聲60 min，濾過(guò)，濾液水浴蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國(guó)藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯(12∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液無(wú)干擾(圖1 D)。

圖1 薄層色譜圖

2.2 含量測(cè)定[8]

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Merk-C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相:乙腈-水(20∶80);流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;檢測(cè)波長(zhǎng):277 nm。在上述色譜條件下，連翹苷在24 min出峰，理論板數(shù)按連翹苷計(jì)算 n=9 523;供試品溶液色譜在對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)保留時(shí)間上出現(xiàn)一色譜峰，連翹苷峰與其他峰的分離度大于1.5。

2.2.2 溶液制備

稱(chēng)取連翹苷對(duì)照品8.04 mg，精密稱(chēng)定，用甲醇溶解并定容至10 mL，作為對(duì)照品貯備液;精密吸取貯備液1 mL，用甲醇稀釋至10 mL，作為對(duì)照品溶液。取本品10片，研細(xì)，取4 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇15 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，浸漬過(guò)夜，超聲處理25 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5 mL，蒸至近干，加中性氧化鋁1 g拌勻，加置中性氧化鋁柱(200-300目，1 g，內(nèi)徑 1.5 cm)上，用70%乙醇100 mL洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取缺連翹的陰性對(duì)照品4 g，同供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性考察:取連翹苷對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液，照2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明其他成分對(duì)連翹苷含量測(cè)定無(wú)干擾。高效液相色譜圖見(jiàn)圖2。

線(xiàn)性關(guān)系考察:精密吸取對(duì)照品溶液 2，6，8，10，20 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量 X(μg)為橫坐標(biāo)、峰面積值 Y為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖，連翹苷回歸方程為Y=553 564X-6 457.3，r=0.999 9(n=5)。結(jié)果表明，連翹苷進(jìn)樣量在0.160 8～1.608 0μg范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

圖2 高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn):精密吸取對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次。結(jié)果連翹苷峰面積的 RSD為0.82%(n=5)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批樣品(批號(hào)為100321)，精密稱(chēng)取6份，分別照含量測(cè)定法制備供試品溶液并測(cè)定。結(jié)果連翹苷的平均含量為0.037 2%，RSD為2.3%(n=6)，表明方法重復(fù)性較好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密量取同一供試品溶液，在室溫下，分別在0，2，4，6，8 h時(shí)測(cè)定連翹苷峰面積。結(jié)果的 RSD為 1.4%(n=5)，表明樣品中連翹苷在測(cè)定的8 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):取同一批樣品(批號(hào)為100321)，精密稱(chēng)取6份，分別精密加入連翹苷對(duì)照品貯備液1 mL，將甲醇揮干，分別照含量測(cè)定法制備供試品溶液，測(cè)定含量。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 連翹苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2.4 樣品含量測(cè)定

精密稱(chēng)取本品，照含量測(cè)定法測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算樣品中連翹苷含量。結(jié)果批號(hào)分別為100321，100403，100411的3批樣品中連翹苷含量分別為0.28，0.27，0.28 mg/片。根據(jù)2010年版《中國(guó)藥典(一部)》規(guī)定，連翹藥材以連翹苷(C27H34O11)計(jì)，不得少于0.15%;抗病毒分散片以轉(zhuǎn)移率60%計(jì)，每粒含連翹苷(C27H34O11)應(yīng)不低于0.20 mg。故暫訂本品每片含連翹以連翹苷(C27H34O11)計(jì)，應(yīng)不低于0.20 mg。

3 討論

本研究中抗病毒分散片的提取工藝與部頒標(biāo)準(zhǔn)中抗病毒栓以及新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)中抗病毒口服液、抗病毒膠囊、抗病毒糖漿、抗病毒片等不完全相同，因此質(zhì)量控制指標(biāo)及方法不盡相同。此外，本試驗(yàn)還按照2010年版《中國(guó)藥典(一部)》附錄片劑項(xiàng)下規(guī)定，進(jìn)行了質(zhì)量差異、溶出度、分散均勻性及微生物限度等檢測(cè)，均符合規(guī)定。

本試驗(yàn)對(duì)抗病毒分散片中廣藿香的薄層色譜鑒別方法進(jìn)行了研究，以廣藿香對(duì)照藥材、百秋李醇對(duì)照品作對(duì)照，效果均不理想，試驗(yàn)方法還有待進(jìn)一步研究，故暫不列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

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