暖宮孕子膠囊對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的影響

孟慧玲，粱 真，于迎新，韓鳳梅，張清秀，李聰華

(河北省滄州市婦幼保健院，河北 滄州 061000)

雞胚絨毛尿囊膜(chicken chorioallantoic membrahe，CAM)是研究血管形成與抗血管形成的理想體內(nèi)模型，以雞胚絨毛尿囊膜為體內(nèi)模型研究血管新生藥物已成為熱點[1]。暖宮孕子膠囊具有滋陰養(yǎng)血、溫經(jīng)散寒、行氣止痛作用，是一種純中藥制劑，用于血虛氣滯、腰酸疼痛、經(jīng)水不調(diào)、赤白帶下、子宮寒冷、久不受孕等癥。研究證實暖宮孕子膠囊有改善克羅米芬促排卵患者雌激素抵抗的作用。為進一步探討其機制，筆者就暖宮孕子膠囊對CAM血管生成的影響進行了研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

MCO-5AC型二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(日本三洋電器集團);超凈工作臺;倒置顯微鏡;眼科剪;眼科鑷;注射器;微量移液器及吸頭等。暖宮孕子膠囊(威特藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20090224);雞胚(姚官屯種雞場提供);混合纖維素酯微孔濾膜(上海新亞凈化器材廠);氯化鈉注射液(河北天成藥業(yè)股份有限公司，批號為H13022576);乙醇(德州億申康消毒制品有限公司，批號為20030297);丙酮(天津市醫(yī)藥工業(yè)技術(shù)研究所，批號為860912);甲醇(天津市化學(xué)試劑二廠，批號為050310);新吉爾滅(山東瑞泰奇洗滌消毒科技有限公司，批號為20050149)。

1.2 試驗操作

暖宮孕子膠囊制備成相當(dāng)于1 g/mL的藥液，裝入輸液瓶中，100℃熱水浴中處理30 min滅菌備用。將40枚雞胚隨機分為空白組和試驗組，每組20枚。溫水沖洗干凈，1‰新吉爾滅紗布擦洗兩遍消毒，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度(37.8±0.3)℃，培養(yǎng)箱中放入水盤以保持濕度在40～70%，留通氣孔。每天轉(zhuǎn)蛋4次，有利于胚胎發(fā)育均勻，同時每日檢查胚胎發(fā)育情況，隨時淘汰死弱精蛋和死胚及發(fā)育不良的種蛋。第7天，置超凈工作臺上，用牙科砂輪在氣室上方蛋殼處磨切蛋殼，用眼科鑷開1 cm×2 cm窗口，暴露下方的氣室膜，用注射器針頭在內(nèi)膜上輕輕劃破一小孔，勿傷及下面的CAM，用眼科鑷剝?nèi)馐夷?，將預(yù)先剪成直徑5 mm并滅菌的混合纖維素酯微孔濾膜放在CAM兩條卵黃靜脈之間相對無血管處，試驗組加入10μL暖宮孕子膠囊液，空白組加入10μL氯化鈉注射液。然后用滅菌的透明膠紙封閉假氣室，并將雞胚做好分組標(biāo)記，連續(xù)加藥3 d。

3 d后，加入甲醇 -丙酮(1∶1)的固定液，預(yù)固定15 min，待CAM的血管完全凝固后.用眼科鑷去掉CAM平面以上的卵殼和卵殼膜，并用眼科剪以濾紙載體為中心，完整剪下CAM，置盛有蒸餾水的平皿中，用眼科鑷舒展CAM，將載波片置人蒸餾水的平皿，將舒展的CAM平鋪其上，陰干保存。

血管計數(shù)，記錄以載體為中心，半徑1 mm內(nèi)為一級血管，半徑5 mm內(nèi)為二級血管，記錄一二級血管數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

以SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，雞胚存活率進行 χ2檢驗;新生血管數(shù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示。

2 結(jié)果

結(jié)果見表1和表2。

表1 CAM模型試驗成活率

表2 兩組對CAM模型血管生成的影響

3 討論

王蕾等[2]研究發(fā)現(xiàn)，服用補腎生血藥如山茱萸、熟地、枸杞子、龜板膠、當(dāng)歸等后的小鼠血清，可促進CAM的血管生成。張樹成等[3]在對補腎調(diào)經(jīng)方藥作用機制的研究中發(fā)現(xiàn)，老年生理性腎虛的雌性金黃地鼠服用中藥后，子宮組織中血管數(shù)目顯著增加，樹枝狀分支廣泛，可見明確的血管出芽生長，提示中藥具有促進血管生成的作用。

CAM模型常用于血管新生促進或抑制的研究，具有周期短、成本低、易于大樣本重復(fù)等特點，且觀察結(jié)果客觀可靠，是目前研究血管新生常用的活體模型之一 。有報道稱直接加藥于雞胚CAM上，發(fā)現(xiàn)異物刺激過大、雞胚成活率降低，但本試驗沒有發(fā)生此現(xiàn)象，試驗中雞胚發(fā)育正常，且CAM血管生長良好。本研究結(jié)果顯示，試驗組一級血管和二級血管總數(shù)量均較空白組多，證明暖宮孕子膠囊具有促進血管生成的作用。

暖宮孕子膠囊由熟地黃、香附、當(dāng)歸、川芎、白芍等藥物組成，以滋陰養(yǎng)血藥物為主。中醫(yī)理論中活血化瘀、益氣養(yǎng)血、補腎調(diào)經(jīng)、填經(jīng)生血、止血生肌、行氣通脈等理論為中藥促進血管生成的研究提供了依據(jù)。妊娠從著床到胎盤形成都離不開豐富的血液供應(yīng)，離不開血管新生、通透性改變。哺乳動物胚胎植入的過程都伴有豐富的血管生成[4]。本研究顯示暖宮孕子膠囊對雞胚絨毛尿囊膜血管生成有促進作用，可以推斷暖宮孕子膠囊可能是通過促進血管生成而改善促排卵過程中的子宮內(nèi)膜厚度，進而改善克羅米芬促排卵導(dǎo)致的高排卵率、低妊娠率。這為克羅米芬聯(lián)合暖宮孕子膠囊促排卵提供進一步的科學(xué)依據(jù)，但暖宮孕子膠囊促進CAM血管生成的機制有待進一步的研究。

[1]薛慶善.體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社，2001:2.

[2]王 蕾，張樹成，吳志奎，等.雞胚絨毛尿囊膜血管生成模型在中藥研究中應(yīng)用方法探討[J].中藥藥理與臨床，2000，16(6):46-47.

[3]張樹成，吳志奎，王 蕾，等.補腎生血和補腎調(diào)經(jīng)方藥促血管生成作用實驗研究[J].中醫(yī)雜志，2000，41(6):369.

[4]Ong S，Lash G，Baker PN.Angiogenesis and placental growth in normal and compromised pregnancies[J].Baillieres Best Pzact Res Clin Obstet Gynaceol，2000，14(6):969-980.