靶向性沉默DNMT1基因?qū)σ认侔┘?xì)胞DNA甲基化的影響

徐岷 張尤歷 高道鍵 張玉琦 李兆申 高軍 杜奕奇 龔燕芳 吳洪玉 高飛

·論著·

靶向性沉默DNMT1基因?qū)σ认侔┘?xì)胞DNA甲基化的影響

徐岷 張尤歷 高道鍵 張玉琦 李兆申 高軍 杜奕奇 龔燕芳 吳洪玉 高飛

目的觀察DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)基因沉默后對(duì)人胰腺癌PaTu8988細(xì)胞的DNMT活性及hMLH-1基因CpG島DNA甲基化狀態(tài)的影響。方法由美國(guó)Ambion公司設(shè)計(jì)合成DNMTl siRNA和陰性對(duì)照siRNA，分別用15、30 nmol/L的濃度轉(zhuǎn)染胰腺癌PaTu8988細(xì)胞，以未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞作為對(duì)照。應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)DNMT1 mRNA和蛋白的表達(dá)；用DNMT活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)其活性；用亞硫酸氫鹽測(cè)序PCR(BSP)法檢測(cè)hMLH-1基因CpG島的甲基化狀態(tài)；實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)hMLH-1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果轉(zhuǎn)染48 h后，DNMT1 siRNA15、30 nmol/L組細(xì)胞DNMT1 mRNA表達(dá)量分別為0.573±0.026和0.143±0.044，顯著低于對(duì)照組的1.020±0.217及陰性siRNA 15、30 nmol/L組的0.900±0.475和0.938±0.327(P值均<0.05)；DNMT1 siRNA組的DNMT1蛋白表達(dá)亦低于對(duì)照組和陰性siRNA組。DNMT1 siRNA15、30 nmol/L組細(xì)胞DNMT活性分別為0.364±0.124和0.250±0.072，明顯低于對(duì)照組的0.931±0.065及陰性siRNA 15、30 nmol/L組的0.665±0.055和0.472±0.040。DNMT活性與DNMTl mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.69，P<0.01)。DNMTl RNA干擾后導(dǎo)致hMLH-1基因CpG位點(diǎn)的8個(gè)甲基化減少到1個(gè)甲基化。結(jié)論DNMTl siRNA能特異性抑制胰腺癌PaTu8988細(xì)胞DNMTl 基因的表達(dá)，明顯抑制DNMT的活性，并引起hMLH-1基因CpG島去甲基化。

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶l； RNA，小分子干擾； 胰腺腫瘤； 甲基化

DNA甲基化是重要的基因表觀修飾方式之一，是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5′端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?′甲基胞嘧啶。DNMT1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中是含量最多的DNMTs，主要起著維持DNA甲基化的作用。本實(shí)驗(yàn)將DNMT1小分子干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)轉(zhuǎn)染人胰腺癌PaTu8988細(xì)胞，觀察DNMTl基因沉默后對(duì)細(xì)胞DNMT活性、hMLH-1 mRNA及其CpG島甲基化位點(diǎn)的影響。

材料和方法

一、細(xì)胞分組

人胰腺癌PaTu8988細(xì)胞系由德國(guó)Marburg市Philipps大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)和分子病理學(xué)研究所Elsasser博士惠贈(zèng)，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。DNMTl siRNA(ID：110914)和陰性對(duì)照siRNA(陰性siRNA)由美國(guó)Ambion公司設(shè)計(jì)合成。DNMTl siRNA序列：正義鏈為5′-GGCGGCUCAAAGAUUUGGATT-3′，反義鏈為5′-UCCAAAUCUUUGAGCCGCCTG-3′。 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分為對(duì)照組，陰性siRNA 15、30 nmol/L組，DNMTl siRNA 15、30 nmol/L組。待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～70%時(shí)，采用Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen公司)將不同濃度的陰性siRNA或DNMT1 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，對(duì)照組僅加入等容積Opti-DMED培養(yǎng)液。培養(yǎng)6 h后更換為含10%小牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集各組細(xì)胞，PBS洗3次。

二、DNMT1 mRNA、hMLH-1 mRNA表達(dá)的檢測(cè)

采用Trizol提取各組細(xì)胞的總RNA。實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)DNMT1 mRNA的表達(dá)。應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，DNMT1引物：5′-GTGGGGGACTGTGTCTCTGT-3′和5′-TGAAAGCTGCATGTCCTCAC-3′，擴(kuò)增片段204 bp；hMLH-1引物：5′-TCCCGAAAGGAAATGACTGC-3′和5′-CTCCGATAACCTGAGAAC-ACCAAA-3′，擴(kuò)增片段279 bp；內(nèi)參GAPDH引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′和5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3′，擴(kuò)增片段142 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR儀為7500型(美國(guó)Applied Biosystems公司)。擴(kuò)增條件：95℃ 1 min；95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 45 s，共 40個(gè)循環(huán)。mRNA相對(duì)表達(dá)量(RQ)=2-ΔΔCT，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。以對(duì)照組mRNA表達(dá)量的均數(shù)為1，計(jì)算其他各組mRNA表達(dá)量的倍數(shù)。

三、DNMT1蛋白檢測(cè)

提取上述各組細(xì)胞總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，取20 μg蛋白常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)DNMT1蛋白的表達(dá)。兔抗人DNMT1多抗(美國(guó)Abcom公司)1∶1000稀釋，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗1∶2000稀釋，最后加入ECL反應(yīng)液，暗室顯影、定影后掃描。以β -actin蛋白表達(dá)作為內(nèi)參照。

四、DNMT活性檢測(cè)

按照核蛋白提取試劑盒(美國(guó)Epigentek公司)說(shuō)明書提取各組細(xì)胞核蛋白，采用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Epigentek公司)測(cè)定細(xì)胞核蛋白中DNMT活性，以吸光值表示。

五、hMLH-1基因CpG島的甲基化狀態(tài)檢測(cè)

采用酚/氯仿抽提法提取細(xì)胞總DNA，采用DNA甲基化試劑盒(美國(guó)Zymo Research公司)進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理。應(yīng)用BSP法檢測(cè)hMLH-1基因CpG島的甲基化。參考文獻(xiàn)[1]設(shè)計(jì)引物，上游5′-GGAGTGAAGGAGGTTAYGGGTAAGT-3′，下游5′-AAAAACRATAAAACCCTATACCTAATCTATC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物182 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min，94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定，用膠回收試劑盒(維特潔公司)回收及純化PCR產(chǎn)物，并插入pMD-18T載體(日本TAKARA公司)，送上海美季生物公司測(cè)序。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組細(xì)胞DNMTl mRNA及蛋白的表達(dá)

對(duì)照組，陰性siRNA15、30 nmol/L組，DNMTl siRNA 15、30 nmol/L組細(xì)胞的DNMT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.020±0.217、0.900±0.475、0.938±0.327、0.573±0.026和0.143±0.044。對(duì)照組與陰性siRNA組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；DNMT1 siRNA組顯著低于其他各組(P值均<0.05)，且其30 nmol/L組更顯著低于DNMT1 siRNA 15 nmol/L組(t=3.692，P<0.05)。

各組DNMT1蛋白表達(dá)變化同mRNA的表達(dá)(圖1)。

圖1 各組細(xì)胞DNMT1蛋白的表達(dá)

二、各組細(xì)胞DNMT活性的變化及其與DNMTl mRNA表達(dá)的相關(guān)性

對(duì)照組，陰性siRNA15、30 nmol/L組，DNMTl siRNA 15、30 nmol/L組細(xì)胞DNMT活性的吸光值分別為0.931±0.065、0.665±0.055、0.472±0.040、0.364±0.124和0.250±0.072；抑制率分別為(0.00±6.96)%、(28.61±5.88)%、(49.27±4.29)%、(60.90±13.29)%和(73.15±7.77)%，依次逐漸增加，兩兩組間的抑制率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DNMT活性與DNMTl mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.69，P<0.01，圖2)。

三、各組細(xì)胞hMLH-1 mRNA表達(dá)及CpG島的甲基化狀態(tài)

對(duì)照組，陰性siRNA15、30 nmol/L組，DNMTl siRNA 15、30 nmol/L組細(xì)胞的hMLH-1 mRNA表達(dá)量分別為1.012±0.241、0.986±0.325、1.021±0.303、3.264±0.617和5.733±0.847。對(duì)照組與陰性siRNA組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.011，P>0.05)；DNMT1 siRNA組顯著高于其他各組(P值均<0.05)，且其30 nmol/L組更顯著高于15 nmol/L組(t=4.08，P<0.05)。擴(kuò)增的hMLH-1基因CpG島的DNA包含22個(gè)CpG位點(diǎn)，RNA干擾后導(dǎo)致hMLH-1基因CpG位點(diǎn)的8個(gè)甲基化減少到1個(gè)甲基化(圖3)。

圖2 DNMTl mRNA表達(dá)與DNMTl活性的相關(guān)性

黑點(diǎn)表示甲基化的CpG位點(diǎn)，黑圈表示非甲基化的CpG位點(diǎn)

圖3RNA干擾后各組hMLH-1基因CpG島的甲基化狀況

討 論

腫瘤的發(fā)生與多種基因的異常甲基化密切相關(guān)，包括抑癌基因、DNA損傷修復(fù)基因及與腫瘤代謝和浸潤(rùn)相關(guān)的基因。腫瘤組織中的DNA甲基化異?？偟奶卣鳛閺V泛低甲基化伴局部高甲基化[1]。通常情況下，DNA高甲基化不僅可以直接或間接影響基因轉(zhuǎn)錄，也可導(dǎo)致C-T突變而引起基因表達(dá)異常，導(dǎo)致細(xì)胞惡變，最終形成腫瘤[2-3]。DNA的去甲基化與轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)、基因活化和行使功能有關(guān)，因此針對(duì)DNA去甲基化的治療是治療腫瘤的新途徑。

Robert等[4]研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論使用反義核苷酸還是siRNA選擇性沉默DNMT1表達(dá)，均能明顯降低結(jié)腸癌HCT116、SW48和SW480細(xì)胞的DNMT的活性，并引起細(xì)胞總體甲基化水平下降。Ting等[5]研究發(fā)現(xiàn)，沉默DNMT1基因后，結(jié)腸癌SW48細(xì)胞、膀胱癌T24細(xì)胞內(nèi)仍維持了DNA高甲基化狀態(tài)。但在乳腺癌細(xì)胞中干擾DNMT1 基因，甲基化轉(zhuǎn)移酶的活性降低90%。然而，Rhee等[6-7]靶向性沉默DNMT1基因只能引起結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞總體甲基化水平下降20%，不能有效引起抑癌基因的重新表達(dá)。而同時(shí)沉默DNMT1和DNMT3b基因表達(dá)，可以引起細(xì)胞總體甲基化水平下降95%，許多抑癌基因重新表達(dá)，有效抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。Sowinska等[8]構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)沉默DNMT1和(或)DNMT3b基因的乳腺癌MCF-7細(xì)胞和胰腺癌AsPC1細(xì)胞，分別引起甲基化水平下降59%、57%、45%和38%，聯(lián)合干擾兩個(gè)基因可引起CXCL12啟動(dòng)子CpG島甲基化水平下降75%和68%。Leu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合沉默DNMT1和DNMT3b基因可抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，其效果明顯強(qiáng)于單獨(dú)沉默DNMT3b基因；聯(lián)合兩種siRNA干擾引起癌細(xì)胞去甲基化的作用亦明顯強(qiáng)于單獨(dú)沉默DNMT1或DNMT3b基因。

本研究結(jié)果顯示，DNMT1 siRNA可以高效、特異性地抑制DNMT1基因的表達(dá)，同時(shí)DNMT活性抑制率達(dá)60%以上，DNMT活性與DNMTl mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，支持DNMT1在DNMT活性中占主導(dǎo)作用的觀點(diǎn)，與其他部分研究結(jié)果一致[4-6]。

Robert等[4]研究發(fā)現(xiàn)，靶向性沉默DNMT1基因能明顯降低結(jié)腸癌HCT116、SW48和SW480細(xì)胞內(nèi)抑癌基因CDKN2A的去甲基化和基因表達(dá)增加。Jung等[10]使用siRNA靶向性沉默DNMT1基因，可引起CDKN2A、RASSF1A等抑癌基因去甲基化和重新表達(dá)。Ting等[5]研究發(fā)現(xiàn)，沉默DNMT1基因后，乳腺癌細(xì)胞中Cdkn2a、Sfrp1和Gata4基因的啟動(dòng)子發(fā)生去甲基化，基因表達(dá)增加。Suzuki等[11]通過(guò)沉默DNMT1基因可以使非小細(xì)胞肺癌NCI-H1299和乳腺癌HCC1954細(xì)胞的RASSF1A、p16ink4A、CDH1和HPP1基因啟動(dòng)子的甲基化水平降低80%，并使這些基因重新表達(dá)。提示DNMT1基因也可通過(guò)調(diào)

控hMLH-1基因的甲基化狀態(tài)，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖。人類錯(cuò)配修復(fù)基因1(hMLH-1)是與細(xì)胞增殖有關(guān)的一個(gè)基因。本研究結(jié)果顯示，沉默DNMT1基因后hMLH-1 mRNA表達(dá)增加，其啟動(dòng)子的CpG島呈現(xiàn)去甲基化狀態(tài)，與上述研究結(jié)果類似。

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EffectsofDNAmethyhransferase1genesilencingonDNAmethylationofpancreaticcancer

XUMin,ZHANGYou-li,GAODao-jian,ZHANGYu-qi,LIZhao-shen,GAOJun,DUYi-qi,GONGYan-fang,WUHong-yu,GAOFei.

DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang212001,China

Correspondingauthor:GAOFei,Email：soar1999@163.com

ObjectiveTo assess the effects of DNA methyhransferase 1 (DNMT1) gene silencing on DNMTs activity and methylated CpG sites of hMLH-1 in pancreatic cancer cell line PaTu8988.MethodsDNMTl siRNA and negative control siRNA was constructed by Ambion Company of United States. Then they were transfected into pancreatic cancer cell line PaTu8988 at the concentrations of 15, 30 nmol/L, and the cells without transfection was used as the control group. Real-time PCR and Western blotting were applied to detect the DNMTl mRNA and protein expression, and DNMTs activity was detected by using DNMTs activity assay kit. Change of methylation of CpG island of hMLH-1 was detected by bisulfite sequencing PCR (BSP). The expression of hMLH-1 mRNA was detected by Real-time PCR.ResultsAt 48 h after transfection, Real-time RT-PCR analysis showed that the levels of DNMT1 mRNA in DNMT1 siRNA group (15 nmol/L) and DNMT1 siRNA group (30 nmol/L) were 0.573±0.026and0.143±0.044，which were significantly lower than those in control group 1.020±0.217 and negative siRNA 15 nmol/L group 0.900±0.475, and negative siRNA 30 nmol/L group 0.938±0.327(P<0.05). Western blotting analysis showed that the level of DNMT1 protein of DNMT1 siRNA group was also lower than those of negative siRNA and control groups. DNMT activity in DNMT1 siRNA15, 30 nmol/L groups was 0.364±0.124and0.250±0.072, which were significantly lower than those in control group 0.931±0.065and negative siRNA group 0.665±0.055 and 0.472±0.040.DNMT activity was positively correlated with DNMTl mRNA expression (r=0.69，P<0.01). DNMTl RNA interference decreased 8 methylated CpG sites of hMLH-1 to 1 site.ConcluslonsDNMTl siRNA can specifically inhibit the expression of DNMTl gene of PaTu8988 and DNMT activity, and can decrease methylated CpG sites of hMLH-1 gene.

DNA methyhransferase 1 (DNMT1); RNA，small interfering; Pancreatic neoplasms; Methylation

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.04.006

江蘇省自然科學(xué)基金(BK2009210)；江蘇省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目(H200836)；遼寧省博士科研啟動(dòng)基金(20101131)；鎮(zhèn)江市科研計(jì)劃項(xiàng)目(SH2009012)

212001 江蘇鎮(zhèn)江，江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院消化科(徐岷、張尤歷)；第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院消化科(高道鍵、張玉琦、李兆申、高軍、杜奕奇、龔燕芳、吳洪玉)；沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院內(nèi)窺鏡科(高飛)

高飛，Email：soar1999@163.com

2011-11-16)

(本文編輯：呂芳萍)