米非司酮治療子宮肌瘤的療效相關(guān)因子研究

江 娜 丁盛娣 陳文兵 朱雪瓊

子宮肌瘤好發(fā)于生育年齡婦女，是最常見(jiàn)的盆腔良性腫瘤，也是導(dǎo)致子宮切除術(shù)的最常見(jiàn)原因。近年研究表明:孕激素在子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著和雌激素同樣重要的作用［1］。孕激素可能是通過(guò)某些生長(zhǎng)因子如:胰島素樣生長(zhǎng)因子 －1(insulin－like growth factor－1，IGF－1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β(transforming growth factor－β，TGF－β)等來(lái)發(fā)揮調(diào)控子宮肌瘤生長(zhǎng)的作用［2］。

米非司酮是一種抗孕激素受體和弱的抗糖皮質(zhì)激素受體的甾體類(lèi)藥物。臨床上米非司酮常被用于治療有癥狀的子宮肌瘤，但是米非司酮只對(duì)部分子宮肌瘤有效，而且存在停藥后反跳生長(zhǎng)的現(xiàn)象，因此大多被用于術(shù)前縮小子宮肌瘤體積以糾正貧血和減少術(shù)中出血［3］。迄今為止，關(guān)于米非司酮治療子宮肌瘤療效相關(guān)因子的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)照分析米非司酮治療子宮肌瘤組和未治療組、米非司酮治療有效組和治療無(wú)效組中IGF－1、TGF－β和肥大細(xì)胞的表達(dá)差異，以期尋找米非司酮治療子宮肌瘤療效相關(guān)的因子。

材料與方法

1．病人和標(biāo)本:2005～2009年在溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科就診的患者66例，均為絕經(jīng)前的婦女，臨床癥狀明顯，并經(jīng)過(guò)婦科檢查及B型超聲證實(shí)，符合子宮肌瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)。這些病人分成兩組，第1組包括34例病人(平均年齡為44．96±6．55歲)，經(jīng)米非司酮(浙江仙居制藥公司生產(chǎn)，12.5mg/25mg口服每天1次)治療后行肌瘤剝除術(shù)或子宮切除術(shù)，第2組包括32例病人(平均年齡為43．50±5．84歲)，直接行手術(shù)治療。第1組病人中，用藥前及用藥3個(gè)月后分別行盆腔及婦科檢查，用B超測(cè)量子宮肌瘤的三維徑線(xiàn)，按公式V=πabc/6(a、b、c分別代表肌瘤在三維的3個(gè)切面的直徑)的方法計(jì)算子宮肌瘤體積［4］。對(duì)于多發(fā)性子宮肌瘤者，計(jì)算最大子宮肌瘤的體積作為代表性結(jié)果。子宮肌瘤體積縮小≥20%為治療有效，子宮肌瘤體積縮小20%以下的為治療無(wú)效。得到有效組20例，無(wú)效組14例。

2．免疫組化染色:標(biāo)本用低溫生理鹽水去除血液和污漬，10%甲醛固定，蠟塊包埋，4μm連續(xù)切片。所有肌瘤標(biāo)本均經(jīng)病理科醫(yī)生確診為普通型子宮平滑肌瘤。使用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白－過(guò)氧化物酶法(streptavidin peroxidase)SP法。切片脫蠟入水，組織抗原微波修復(fù)，先中低火5min，停5min后再中低火3min;PBS 3min，3次;3%H2O2阻斷過(guò)氧化物酶活性10min;PBS 3min，3次;正常山羊血清室溫孵育10min;滴加一抗(IGF－1鼠抗人抗體1∶50稀釋?zhuān)绹?guó) Santa Cruz公司;TGF－β鼠抗人抗體1∶200稀釋?zhuān)绹?guó)Santa Cruz公司;即用型肥大細(xì)胞類(lèi)胰蛋白酶鼠抗人抗體，福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)，4℃過(guò)夜，PBS 5min，3次;生物素標(biāo)記二抗室溫孵育30min，PBS 3min，3次;DAB顯色，顯微鏡觀察，水洗終止;蘇木素復(fù)染，淡氨水返藍(lán);樹(shù)脂封片，光鏡下觀察。每一批染色均設(shè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照。以PBS代替一抗做陰性對(duì)照，用已知有表達(dá)的乳腺癌切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

3．染色結(jié)果判斷:(1)IGF－1和TGF－β染色結(jié)果判斷:IGF－1和TGF－β的陽(yáng)性表達(dá)黃色顆粒主要定位于細(xì)胞質(zhì)。每張切片觀察10個(gè)隨機(jī)400倍視野，每個(gè)視野觀察100個(gè)細(xì)胞，根據(jù)免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分別進(jìn)行陽(yáng)性率及著色強(qiáng)度評(píng)分。I代表染色強(qiáng)度:無(wú)著色為0分，淺黃色為1分，淺棕色為2分，深棕色為3分。P代表同一染色強(qiáng)度細(xì)胞所占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分率:無(wú)著色為0分，＜25%為1分，25% ～49%為2分，50%～74%為3分，≥75%為4分。將陽(yáng)性率和染色強(qiáng)度兩項(xiàng)評(píng)分的乘積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。(2)肥大細(xì)胞染色結(jié)果判斷:肥大細(xì)胞類(lèi)胰蛋白酶胞質(zhì)著色。類(lèi)胰蛋白酶陽(yáng)性者胞質(zhì)呈黃棕色。肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)采用隨機(jī)連續(xù)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野(×400)的肥大細(xì)胞數(shù)，再計(jì)算每個(gè)高倍視野下肥大細(xì)胞平均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

4．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用 SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，IGF－1和TGF－β的表達(dá)為非正態(tài)分布資料，故數(shù)據(jù)采用中位數(shù)(P25－P75)表示，兩組之間的比較采用Mann－Whitney U檢驗(yàn)。肥大細(xì)胞數(shù)為正態(tài)分布，而且兩組之間方差齊性，故數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩組間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1．IGF－1在米非司酮治療后手術(shù)組和直接手術(shù)組的表達(dá)比較，見(jiàn)圖1。在米非司酮治療后手術(shù)組中，IGF－1的表達(dá)為1(0～4)。在直接手術(shù)組中，IGF－1的表達(dá)為2(2～4)，經(jīng) Mann－Whitney U檢驗(yàn)，兩組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。米非司酮治療后手術(shù)組中IGF－1的表達(dá)明顯低于直接手術(shù)組。

圖1 IGF－1在直接手術(shù)子宮肌瘤患者中的表達(dá)(SP，×400)

2．IGF－1在米非司酮治療子宮肌瘤有效組和米非司酮治療子宮肌瘤無(wú)效組中的表達(dá):米非司酮治療子宮肌瘤無(wú)效組IGF－1的表達(dá)為0(0～1)，米非司酮治療子宮肌瘤有效組IGF－1的表達(dá)為4(0．25～6．00)，經(jīng)Mann－Whitney U檢驗(yàn)，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05)。

3．TGF－β在米非司酮治療后手術(shù)組和直接治療組中的表達(dá):在米非司酮治療后手術(shù)組，TGF－β的表達(dá)為4(2～6)。在直接手術(shù)組中，TGF－β表達(dá)為4(2～6)，經(jīng)Mann－Whitney U檢驗(yàn)，兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。

4．米非司酮治療子宮肌瘤有效組和無(wú)效組中TGF－β的表達(dá):米非司酮治療子宮肌瘤有效組TGF－β的表達(dá)為4(2．5～6．0)，米非司酮治療子宮肌瘤無(wú)效組TGF－β的表達(dá)為4(2．0～4．5)，經(jīng) Mann－Whitney U檢驗(yàn)，兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。

5．肥大細(xì)胞在米非司酮治療后手術(shù)組和直接治療組中的表達(dá)，見(jiàn)圖2。肥大細(xì)胞在米非司酮治療后手術(shù)組中的計(jì)數(shù)為7．38±1．38/HPF，在直接手術(shù)組7．23 ±0．80/HPF，經(jīng) t檢驗(yàn)，兩組間肥大細(xì)胞的表達(dá)無(wú)顯著性差異(P＞0．05)。

圖2 肥大細(xì)胞在子宮肌瘤中的表達(dá)(SP，×400)

6．米非司酮治療子宮肌瘤有效組和無(wú)效組中肥大細(xì)胞的表達(dá):肥大細(xì)胞在米非司酮治療有效組中的計(jì)數(shù)為7．43±2．96/HPF，在米非司酮治療無(wú)效組中7．66 ±1．93/HPF，經(jīng) t檢驗(yàn)，兩組間肥大細(xì)胞的表達(dá)無(wú)顯著性差異(P＞0．05)。

討 論

米非司酮的使用可以縮小子宮肌瘤體積，但只對(duì)部分患者有效，而且存在停藥后反跳生長(zhǎng)的情況［3］，但分子機(jī)制未明。研究表明:卵巢分泌的雌孕激素通過(guò)子宮肌瘤局部生長(zhǎng)因子的作用，比如IGF－1、TGF－β、肥大細(xì)胞等形成一個(gè)復(fù)雜的分子系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)上調(diào)細(xì)胞的增殖和下調(diào)細(xì)胞的凋亡來(lái)調(diào)控子宮肌瘤的生長(zhǎng)。Konon等［5］研究發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞可能通過(guò)貯存于其中的類(lèi)胰蛋白酶來(lái)促進(jìn)子宮肌瘤周?chē)难苌伞⒎蚀蠹?xì)胞制成懸液注入動(dòng)物體內(nèi)，可以導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)加速;阻止肥大細(xì)胞脫顆粒或減少肥大細(xì)胞數(shù)目均能抑制腫瘤生長(zhǎng)。肥大細(xì)胞釋放的血管內(nèi)皮生成因子(VEGF)、成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β(TGF－β)具有調(diào)控血管生長(zhǎng)的作用。TGF－β在促進(jìn)子宮肌瘤生成的細(xì)胞外基質(zhì)的增殖中起了重要作用。IGF－1以促有絲分裂劑的作用促進(jìn)子宮肌瘤的生長(zhǎng)。在體外培養(yǎng)的子宮肌瘤細(xì)胞中，IGF－1明顯增加子宮肌瘤細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)，抑制細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)子宮肌瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［6］。研究發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)子宮肌瘤局部IGF－1及其受體濃度在mRNA及其蛋白水平均明顯高于周?chē)＜蛹?xì)胞，且不受月經(jīng)周期的影響［7］。然而孕激素受體拮抗劑米非司酮治療子宮肌瘤的療效與這些生長(zhǎng)因子的相關(guān)性國(guó)內(nèi)外均尚未見(jiàn)報(bào)道。

Nakayama等［8］研究發(fā)現(xiàn)，予 GnRH －a治療后的子宮肌瘤中IGF－1的表達(dá)較未治療組明顯降低。Yamada等［9］研究表明，孕激素對(duì)于子宮肌瘤有雙重的作用，一方面孕激素通過(guò)上調(diào)表皮生長(zhǎng)因子和Bcl－2來(lái)促進(jìn)肌瘤的生長(zhǎng)，另一方面通過(guò)下調(diào)IGF－1來(lái)抑制子宮肌瘤生長(zhǎng)。Wang等［10］采用體外細(xì)胞培養(yǎng)方式，發(fā)現(xiàn)一種新型的孕激素受體調(diào)節(jié)劑可以抑制子宮平滑肌細(xì)胞中IGF－1的表達(dá)，但是卻對(duì)正常子宮肌層細(xì)胞的IGF－1的表達(dá)無(wú)影響。本研究發(fā)現(xiàn)，米非司酮用藥組子宮肌瘤中IGF－1的表達(dá)明顯低于未用藥組，而用藥后手術(shù)組和直接手術(shù)組中TGF－β、肥大細(xì)胞的表達(dá)無(wú)差異，表明米非司酮可以下調(diào)子宮肌瘤中IGF－1的表達(dá)。本研究還發(fā)現(xiàn)，米非司酮治療有效組TGF－β、肥大細(xì)胞的表達(dá)與治療無(wú)效組無(wú)差異，而米非司酮治療有效組IGF－1的表達(dá)與治療無(wú)效組有顯著性差異，表明米非司酮治療子宮肌瘤的療效與TGF－β、肥大細(xì)胞無(wú)關(guān)，而與IGF－1的表達(dá)相關(guān)，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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