EGFR蛋白在食管鱗癌中的表達(dá)及其臨床意義

吳金訓(xùn)，余英豪，劉 偉

(中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)福州總醫(yī)院病理科，福州350025)

食管癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生率和病死率居第4位[1]。目前食管癌的治療仍以手術(shù)治療為主，放療、化療為輔，70%的患者確診時(shí)已處于臨床中晚期，化療效果不明顯，5年生存率不足20%，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，尋求新的治療靶點(diǎn)，制訂新的化療方案是臨床迫切需要解決的問題[2]。鑒于目前國(guó)內(nèi)尚未見食管癌中表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)蛋白表達(dá)的大宗病例研究，該項(xiàng)研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)食管鱗癌組織中EGFR的表達(dá)，探討EGFR蛋白表達(dá)與食管癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征的關(guān)系，以期為食管癌患者靶向治療的深入研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2004年1月至2010年6月在南京軍區(qū)福州總醫(yī)院手術(shù)切除的食管鱗癌標(biāo)本1300例，選擇其中臨床資料完整的1034例進(jìn)行研究，其中男778例，女256例，年齡24～87(平均56.9)歲。所有病例術(shù)前均未行放療、化療。肉眼分型為蕈傘型、潰瘍型、髓質(zhì)型、縮窄型。食管鱗癌TNM分期采用AJCC標(biāo)準(zhǔn)(2002)[3]。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器與試劑試劑購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司，一抗為鼠抗人單克隆抗體EGFR。試劑盒選用EliVisionTM plus試劑盒;石蠟切片機(jī)(LEICA RM2245);顯微鏡(OLYMPUS BX51);電熱恒溫干燥箱(上海-恒科技有限公司)。所有標(biāo)記均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照并用磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3方法 手術(shù)標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，3 μm厚連續(xù)切片，分別進(jìn)行HE和免疫組織化學(xué)染色。采用EliVisionTM plus方法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色的主要步驟:石蠟切片、脫蠟、水化，磷酸鹽緩沖液(phosplate buffer saline，PBS)沖洗3次，每次沖洗3 min;胃酶抗原修復(fù)，37℃ 10 min;加3%過氧化氫溶液，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;PBS沖洗3次，每次沖洗3 min;加第一抗體，室溫下孵育60 min;PBS沖洗3×5 min;室溫下孵育20 min;PBS沖洗3次，每次沖洗3 min;加酶標(biāo)抗鼠聚合物，室溫下孵育30 min;PBS沖洗3次，每次沖洗3 min;加新配制的3，3'-二氨基聯(lián)苯胺顯色液，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，0.1%鹽酸分化，自來(lái)水沖洗，PBS沖洗返藍(lán);梯度乙醇脫水干燥，中性樹脂封片。

1.4EGFR過表達(dá)的判斷標(biāo)準(zhǔn) 腫瘤細(xì)胞不著色或＜10%的腫瘤細(xì)胞著色為陰性，≥10%的腫瘤細(xì)胞著色為陽(yáng)性，并根據(jù)腫瘤陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占比例分為10%～25%為弱陽(yáng)性(+)，＞25%為強(qiáng)陽(yáng)性(++)[2]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1EGFR蛋白在食管鱗癌中的表達(dá) 食管鱗癌組織中EGFR陽(yáng)性表達(dá)定位于胞膜，少量定位于胞質(zhì)，其表達(dá)呈明顯的異質(zhì)性(圖 1)。癌旁(距癌灶＞2 cm)非腫瘤性食管黏膜未見EGFR過表達(dá)(圖2)。

2.2EGFR蛋白表達(dá)與食管鱗癌患者臨床及病理參數(shù)的關(guān)系 在1034例食管鱗癌組織中EGFR過表達(dá)率高達(dá)74.9%(774/1034)，陰性表達(dá)260例。EGFR蛋白過表達(dá)陽(yáng)性率與患者性別，年齡，腫瘤大小，肉眼分型，TNM分期，浸潤(rùn)深度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床及病理參數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而高、中分化胃癌中EGFR的表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于低、未分化胃癌(P ＜0.05)(表1)。

圖1 EGFR蛋白在食管鱗癌中過表達(dá)(×100)

圖2 癌旁非腫瘤性食管黏膜EGFR陰性(×100)

表1 EGFR蛋白過表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 [例(%)]

3 討論

EGFR是原癌基因 C-erbB-1的表達(dá)產(chǎn)物，是EGFR家族的成員之一，即ErbB1。EGFR基因定位于人第 7號(hào)染色體的短臂(7p12.3～p12.1)，長(zhǎng)約118 kb，含有28個(gè)外顯子，編碼一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為170 ×103的糖蛋白[3]。劉偉等[4]在前期研究中發(fā)現(xiàn)，EGFR在胃癌中的過表達(dá)率為17.03%，且其表達(dá)與浸潤(rùn)深度、組織類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)(P＜0.05)，EGFR過表達(dá)可以作為評(píng)價(jià)胃癌惡性生物學(xué)行為和預(yù)后的參考指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌、肺癌以及乳腺癌中均存在EGFR蛋白過表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移等相關(guān)[5-6]。

該項(xiàng)研究結(jié)果顯示，1034例食管鱗癌EGFR過表達(dá)率為74.9%(774/1034)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7-9]。關(guān)于EGFR蛋白過表達(dá)與食管鱗癌患者的臨床參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性尚有爭(zhēng)議。李洪勝等[10]觀察42例食管癌，局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的EGFR陽(yáng)性率高于無(wú)局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(56.52%vs 26.32%，P ＜0.05);遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者EGFR陽(yáng)性率高于無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者(47.62%vs 27.08%，P ＜0.05)。Wang 等[11]報(bào)道 103 例食管及與胃交界處腺癌，EGFR蛋白過表達(dá)率為32%(33/103)，EGFR蛋白過表達(dá)與病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期有關(guān)，而與腫瘤分化無(wú)關(guān)，且具有EGFR過表達(dá)患者的預(yù)后較差。然而，有些學(xué)者認(rèn)為EGFR蛋白過表達(dá)與患者的臨床參數(shù)及預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)性[12-13]。該項(xiàng)研究中EGFR蛋白過表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小、肉眼分型、TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)均無(wú)相關(guān)性(P＞0.05)，而高、中分化胃癌中EGFR的表達(dá)顯著高于低、未分化胃癌(P＜0.05)，這種差異可能與樣本量大小不一及陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)。關(guān)于EGFR與食管癌患者的臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性尚需多中心大樣本及標(biāo)準(zhǔn)化的免疫組織化學(xué)檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)。

目前，關(guān)于EGFR與腫瘤靶向治療的研究多數(shù)集中于非小細(xì)胞肺癌，以 EGFR酪氨酸激酶抑制劑為靶點(diǎn)的腫瘤分子靶向治療研究，成為腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。在非小細(xì)胞肺癌中EGFR的突變位點(diǎn)主要位于外顯子18、19、20及外顯子21上，占總突變的95%以上[14-15]。研究表明，EGFR基因酪氨酸激酶ATP結(jié)合域的體細(xì)胞突變及擴(kuò)增與非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼及抗EGFR單克隆抗體西妥昔單克隆抗體治療敏感性密切相關(guān)。在EGFR突變患者中應(yīng)用吉非替尼及西妥昔單克隆抗體有效率可達(dá)80%以上，而EGFR野生型患者的有效率在10%以下[16-17];具有EGFR基因擴(kuò)增患者有效率達(dá)40%以上，而EGFR基因無(wú)擴(kuò)增患者有效率在10%以下[18]。EGFR在食管癌中的過表達(dá)，為其靶向治療提供新的治療靶點(diǎn)，EGFR靶向藥物在食管鱗癌中的使用目前尚無(wú)大規(guī)模的臨床試驗(yàn)報(bào)道，得出的結(jié)論也不一致。Ferry等[19]采用吉非替尼治療進(jìn)展期食管腺癌27例，研究顯示單藥吉非替尼二線治療食管癌，特別是男性、腺癌、低表達(dá)EGFR的病例并未顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)，而食管鱗癌、女性、過表達(dá)EGFR的的病例的治療效果較傳統(tǒng)化療有較明顯的優(yōu)勢(shì)。Janmaat等[20]Ⅱ期臨床研究二線治療食管癌的研究發(fā)現(xiàn)，吉非替尼對(duì)EGFR過表達(dá)的女性、鱗癌患者的有效率較高。雖然早期的臨床試驗(yàn)應(yīng)用針對(duì)EGFR的靶向藥物治療食管癌已顯示出一定的療效，但仍有很大部分患者不能從靶向治療中獲益。研究EGFR蛋白表達(dá)、基因擴(kuò)增及基因突變狀態(tài)對(duì)研究EGFR基因與靶向治療的關(guān)系及篩選對(duì)EGFR靶向治療敏感的患者都具有重要意義。

目前，關(guān)于食管癌中EGFR基因擴(kuò)增率及與蛋白表達(dá)是否具有一致性尚存在爭(zhēng)議。食管癌中EGFR是否存在基因突變，突變位點(diǎn)、突變率如何，對(duì)于具有基因突變或擴(kuò)增的患者應(yīng)用靶向藥物的療效如何等都需要進(jìn)一步的基礎(chǔ)及臨床試驗(yàn)研究。該項(xiàng)本研究的后續(xù)研究中，將選取部分EGFR蛋白過表達(dá)的病例，應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)和直接測(cè)序法分別檢測(cè)EGFR基因擴(kuò)增和基因突變情況，進(jìn)一步探索食管癌EGFR過表達(dá)的機(jī)制，為臨床選取針對(duì)EGFR抗體的靶向藥物提供初步的理論依據(jù)。

[1]Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，2009[J].CA Cancer J Clin，2009，59(4):225-249.

[2]Racette AL，Miller RT.Esophageal carcinoma:matching patients with treatment methods[J].JAAPA，2011，24(1):28-31.

[3]Hofstetter W，Correa AM，Bekele N，et al.Proposed modification of nodal status in AJCC esophageal cancer staging system[J].Ann Thorac Surg，2007，84(2):365-373.

[4]劉偉，余英豪，陳娟，等.EGFR在中國(guó)胃癌患者中的表達(dá)及其臨床意義[J].世界華人消化雜志，2010，18(25):2648-2653.

[5]Ciardiello F，Tortora G.EGFR antagonists in cancer treatment[J].N Engl J Med，2008，358(15):1160-1174.

[6]Ruppert AM，Wislez M，Poulot V，et al.A simple view on lung cancer biology:The EGFR pathway[J].Rev Mal Respir，2011，28(4):565-577.

[7]Rocha-Lima CM，Soares HP，Raez LE，et al.EGFR targeting of solid tumors[J].Cancer Control，2007，14(3):295-3.4.

[8]付建華，楊達(dá)寬，黃云超，等.EGFR和 E-cadherin在食管癌組織中的表達(dá)及兩者的相關(guān)性[J].癌癥，2005，24(2):241-245.

[9]Hanawa M，Suzuki S，Dobashi Y，et al.EGFR protein overexpression and gene amplification in squamous cell carcinomas of the esophagus[J].Int J Cancer，2006，118(5):1173-1180.

[10]李洪勝，王遠(yuǎn)東，譚小軍，等.EGFR及 E-cadherin表達(dá)與食管癌的關(guān)系[J].腫瘤研究與臨床，2005，17(3):175-177.

[11]Wang KL，Wu TT，Choi IS，et al.Expression of epidermal growth factor receptor in esophageal and esophagogastric junction adenocarcinomas association with poor outcome[J].Cancer，2007，109(4):658-667.

[12]Gotoh M，Takiuchi H，Kawabe S，et al.Epidermal growth factor receptor is a possible predictor of sensitivity to chemoradiotherapy in the primary lesion of esophageal squamous cell carcinoma[J].Jpn J Clin Oncol，2007，37(9):652-657.

[13]Kii T，Takiuchi H，Kawabe S，et al.Evaluation of prognostic factors of esophageal squamous cell carcinoma(stageⅡ～Ⅲ)after concurrent chemoradiotherapy using biopsy specimens[J].Jpn J Clin Oncol，2007，37(8):583-589.

[14]Kimura H，Kasahara K，Kawaishi M，et al.Detection of epidermal growth factor receptor mutations in serum as a predictor of the response to gefitinib in patients with non-small cell lung cancer[J].Clin Cancer Res，2006，12(13):3915-3921.

[15]Tiseo M，Rossi G，Capelletti M，et al.Predictors of gefitinib outcomes in advanced non-small cell lung cancer(NSCLC):study of a comprehensive panel of molecular markers[J].Lung Cancer，2010，67(3):355-360.

[16]Miller VA，Riely GI，Zakowski MF.Molecular characteristics of bronchioloalveolar carcinoma and adenocarcinoma，bronchioloalveolar carcinoma subtype，predict response to erlotinib[J].J Clin Oncol，2008，26(9):1472-1478.

[17]Cappuzzo F，Ligorio C，J?nne PA，et al.Prospective study of gefitinib in epidermal growth factor receptor fluorescence in situ hybridization positive/phospho-Akt-positive or never smoker patients with advanced nonsmall-cell lung cancer:the ONCOBELL tria1[J].J Clin Oncol，2007，25(16):2248-2255.

[18]Pinto C，Di Fabio F，Siena S，et al.Phase Ⅱ study of cetuximab in combination with FOLFIRI in patients with untreated advanced gastric or gastroesophageal junction adenocarcinoma(FOLCETUX study)[J].Ann Oncol，2007，18(3):510-517.

[19]Ferry DR，Anderson M，Beddard K，et al.A phase Ⅱ study of gefitinib monotherapy in advanced esophageal adenocarcinoma:evidence of gene expression，cellular，and clinical response[J].Clin Cancer Res，2007，13(19):5869-5875.

[20]Janmaat ML，Gallegos-Ruiz MI，Rodriguez JA，et al.Predictive factors for outcome in a phaseⅡstudy of gefitinib in second-line treatment of advanced esophageal cancer patients[J].J Clin Oncol，2006，24(10):1612-1619.