土圞兒石油醚萃取物的GC－MS分析

胡軼娟 程 林 浦錦寶 梁衛(wèi)青 鄭軍獻(xiàn) 魏克民

土圞兒為豆科植物土圞兒Apios fortunei Maxim．的干燥塊根，浙江省民間用藥。其性涼，味甘、微苦，性平，無(wú)毒，具有清熱解毒、活血止痛、祛風(fēng)化痰、消腫等功效。土圞兒中的化學(xué)成分有生物堿、淀粉等，其中生物堿是一類重要的生理活性物質(zhì)?！顿F州民間草藥》:“散積，理氣，解毒，補(bǔ)脾”?！度珖?guó)中草藥匯編》:“清熱解毒，化痰止咳”。《貴州藥植調(diào)查》:“治蛇咬傷，并治療癀，去毒”［1］。可用于感冒咳嗽，百日咳，咽喉腫痛，疝氣，癰腫，瘰疬。由于其為地方藥材，到目前為止，對(duì)它進(jìn)行的研究并不多。在已見的報(bào)道中，主要對(duì)土圞兒的原植物形態(tài)、藥材性狀、顯微特征等進(jìn)行了初步研究。本研究采用系統(tǒng)溶劑萃取法，從土圞兒植物塊根中得到石油醚萃取物，并用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)土圞兒塊根石油醚萃取物化學(xué)組分進(jìn)行定性研究。分析鑒定了11個(gè)化學(xué)成分，為其藥效評(píng)價(jià)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

材料與方法

1．儀器和試藥:美國(guó)Varian公司450GC－240MS氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀，Varian CP Sil 24CB氣相色譜柱(30m×0.25mm，0.25μm)，土圞兒采自浙江磐安，經(jīng)鑒定為豆科植物土圞兒Apios fortunei Maxim的干燥塊根。石油醚(60～90℃)為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，BSTFA∶TMCS(99∶1)購(gòu)于美國(guó)REGIS公司(批號(hào):CFCQ－270121)。

2．方法［2～11］:(1)石油醚萃取物的制備:取土圞兒藥材6kg，粉碎成粗粉，加8倍量95%乙醇加熱回流提取3次，每次2h，提取液減壓回收乙醇至無(wú)醇味，加熱水至2L成混懸液，用石油醚(60～90℃)萃取3次，每次2L，回收石油醚，得石油醚萃取物86．86g。收率為1．45%。(2)供試品溶液的制備:取石油醚萃取物適量，加環(huán)己烷溶解成6mg/ml溶液，取5ml置具塞試管中，氮吹至干，加入 BSTFA∶TMCS(99∶1)試劑0.5ml，加蓋密封后，振搖 30s，于 80℃烘箱反應(yīng) 1h，取出，放冷，即得。(3)GC－MS條件:毛細(xì)管色譜柱(30m×0．25mm，0．25μm)。汽化溫度250℃;程序升溫，初始溫度 50℃，保持2min，以4℃/min的速度升溫至200℃，保持10min，再以5℃/min的速度升溫至250℃，保持20min;載氣為高純氦氣，流量1m l/min;進(jìn)樣量1μl;分流比 1∶20。EI電離源，70eV;離子源溫度220℃;掃描質(zhì)量范圍(m/z)50～1000。(4)石油醚萃取物的化學(xué)成分分析:對(duì)總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后得到質(zhì)譜圖，通過(guò)工作站N IST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)進(jìn)行檢索，并結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行人工檢索和解析，確認(rèn)各化合物。通過(guò)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，按峰面積歸一化法計(jì)算各化合物在揮發(fā)油中的相對(duì)百分含量。

結(jié) 果

本實(shí)驗(yàn)對(duì)未衍生化前的石油醚萃取物進(jìn)行GC分析，結(jié)果檢測(cè)到的色譜峰較少，且強(qiáng)度低，表明石油醚萃取物中的各化學(xué)成分主要為非揮發(fā)性成分，運(yùn)用BSTFA∶TMCS(99∶1)衍生化后，揮發(fā)性增強(qiáng)，檢測(cè)到較多的色譜峰，且強(qiáng)度增大，見圖1。

圖1 衍生化前(上圖)后(下圖)土圞兒石油醚萃取物的GC色譜圖

比較 了 Varian CP Sil 5CB(30m ×0．25mm，0.25μm)、8CB(30m ×0．25mm，0．25μm)、24CB(30m ×0．25mm，0．25μm)和 HP － INnowax Polyethylene Glycol色譜柱(30m ×0．32mm，0．25μm)4 種色譜柱，結(jié)果Varian CP Sil 24CB的分離效果最佳。對(duì)氣相色譜程序升溫條件進(jìn)行了考察，最終確定上述程序升溫條件下分離度較好，峰數(shù)較多。通過(guò)GC－MS聯(lián)用技術(shù)分析了土圞兒石油醚萃取物中的成分，通過(guò)計(jì)算機(jī)質(zhì)譜庫(kù)檢索，共鑒定出11個(gè)化合物，采用峰面積歸一定量法，求得各化合物的相對(duì)百分含量。土圞兒石油醚萃取物中主要成分及相對(duì)含量見表1，總離子圖見圖2。

表1 土圞兒石油醚提取物中的化學(xué)成分及相對(duì)含量

圖2 土圞兒石油醚萃取物的總離子圖

討 論

從石油醚萃取物中檢出16個(gè)色譜峰，鑒定出11個(gè)化合物，占石油醚萃取物總量的68．75%。其中，有機(jī)酸類成分6個(gè)(54．54%)，肌醇的3種同分異構(gòu)體(27．27%)，另外還有 α －D － 葡萄糖苷(9．09%)、色氨酸(0．29%)。在鑒定的成分中，α－D－葡萄糖苷的相對(duì)含量最高，占57．18%?？赡苁峭翀K兒中淀粉和多糖類成分含量較高，萃取過(guò)程中有部分淀粉和多糖帶入萃取物中。在鑒定出的11個(gè)成分中，6個(gè)為有機(jī)酸類成分，其中2個(gè)為不飽和脂肪酸，9，12－十八碳二烯酸的相對(duì)含量較高，為14．81%。從石油醚萃取物中檢測(cè)出肌醇的3種同分異構(gòu)體，廣泛分布在動(dòng)物和植物體內(nèi)。肌醇(MYO)是環(huán)已六醇中9種立體異構(gòu)體的一種，屬于維生素B族。MYO在細(xì)胞形態(tài)發(fā)生和生成、脂質(zhì)合成、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞生長(zhǎng)方面起著極其重要的作用［12］。從石油醚萃取物中檢出16個(gè)色譜峰，鑒定出11個(gè)化合物，另外5個(gè)色譜峰在10～40min之間，在N IST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)未能找到相應(yīng)的化合物，有待于進(jìn)一步的研究。通過(guò)與空白圖譜對(duì)照，表明在50～70min之間未鑒別的色譜峰為BSTFA∶TMCS(99∶1)衍生劑的絡(luò)合物。本實(shí)驗(yàn)對(duì)土圞兒石油醚萃取物進(jìn)行了體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)濃度為 50μg/ml、100μg/ml時(shí)對(duì) HepG2細(xì)胞株的抑制率分別為31．8%、52．4%，有一定的抑制作用。其他的生物活性還有待于進(jìn)一步研究。

1 宋立人，洪徇，丁緒亮，等．現(xiàn)代中藥學(xué)大辭典(上冊(cè))［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2001:110－111

2 Ana IST，Deisy V，Alex E，et al．Chemical composition of leaf essential oils of Calyptranthesmicrophylla B Holts＆ ML，Myrcia aff fosteri croat and Eugenia octopleura Krug ＆ Urb from Panama［J］．Journal of Essential Oil Research，London，England，2011，23(5):29－33

3 Yamilet IGG，Migdalia MM，Adonis BA，et al．Anti－inflammatory and antioxidant activity of amethanolic extract of phyllanthus orbicularis and its derived flavonols［J］．Journal of Essential Oil Research，2011，23(5):29 －33

4 Jorge AP，Jorge G，Marco AM．A Comparison between the oil，solvent extract and supercritical carbon dioxide extract of Ocimum gratissimum L［J］．Essential Oil Research，1998，10(5):575 －577

5 Mourad B，Mohamed B，Alain M，et al．Antimicrobial activity and chemical composition of Saccocalyx satureioides Coss．et Dur．essential oil and extract obtained bymicrowave extraction．Comparison with hydrodistillation［J］．Essential Oil Research，2008，20(2):174 －178

6 林文津，徐榕青，張亞敏．超臨界CO2萃取與水蒸氣蒸餾法提取太子參揮發(fā)油化學(xué)成分氣質(zhì)聯(lián)用研究［J］．藥物分析雜志，2011，31(7):1300－1303

7 Jazia S，Wissem AW，Thierry T，etal．Chemical composition and antioxidant activities of Tunisian and Canadian Coriander(Coriandrum sativum L．)fruit［J］．Essential Oil Research，2011，23(4):7 －15

8 曹桂云，蔣海強(qiáng)，范輝，等．頂空固相萃取與氣質(zhì)聯(lián)用分析白車軸草中揮發(fā)性成分［J］．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，12(4):219－220

9 Payman H，Mir MA，Hatam H，etal．Headspace solventmicroextraction ofvolatile componentsof Thymus daenensis［J］．Essential Oil Research，2010，22(4):365 －368

10 吳懷恩，梁臣艷，李耀華，等．不同方法提取大頭陳揮發(fā)油的氣質(zhì)聯(lián)用成分分析［J］．藥物分析雜志，2010，30(10):1941－1946

11 陳皓，李攻科．微波萃取氣質(zhì)聯(lián)用測(cè)定蒼耳子水提取液的研究［J］．中山大學(xué)研究生學(xué)刊:自然科學(xué)、醫(yī)學(xué)版，2004，25(2):43－48

12 趙寧寧，吳效科，侯麗輝．肌醇在女性生殖中的作用［J］．世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，6(1):81 －83