血管緊張素Ⅱ1型受體抑制劑對人子宮內(nèi)膜癌裸鼠皮下移植瘤的實驗研究

石海燕，胡維維，許 欣，楊秀媚，賴均鵬，徐園園，陶金華

（佛山市第一人民醫(yī)院 病理科，廣東 佛山528000）

子宮內(nèi)膜癌是婦科常見惡性腫瘤之一。因此，體外建立子宮內(nèi)膜癌模型對研究其發(fā)病機制與治療具有極為重要的意義。本研究應(yīng)用血管生成因子（VEGF）和腫瘤血管密度（MVD）兩個指標(biāo)評估人子宮內(nèi)膜癌祼鼠皮下移植瘤內(nèi)血管形成程度，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞株：人子宮內(nèi)膜癌HEC－1B細(xì)胞株選自上海生命科學(xué)研究所，HEC－1B細(xì)胞以常規(guī)方法復(fù)蘇、培養(yǎng)。取部分細(xì)胞進行種植，其余凍存于液氮罐中。實驗動物：4－6周齡BALB／C雌性裸鼠12只，體重15－16g左右，購自廣東省中山醫(yī)科大學(xué)動物中心，均置于SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。將裸鼠隨機分為腫瘤組和血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）腫瘤抑制組，每組6只。免疫組化試劑：CD34和VEGF均購自DAKO公司；厄貝沙坦購自Sanofi Winthrop Industrie公司。

1.2 方法

1.2.1 HEC－1B細(xì)胞的培養(yǎng)和細(xì)胞懸液的制備及裸鼠接種 復(fù)蘇后的細(xì)胞株置于含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)基中培養(yǎng)。選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，用0.25%濃度的胰酶對其進行消化，然后PBS洗滌細(xì)胞2次；以1 000轉(zhuǎn)／min的轉(zhuǎn)速對細(xì)胞懸液離心5min，收集細(xì)胞，用0.9%濃度的生理鹽水懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106／ml，接種至裸鼠右上肢背部皮下組織。

1.2.2 分組及給藥 接種當(dāng)天把裸鼠隨機分為2組，除正常飲食外，腫瘤組每天胃飼生理鹽水1次0.5ml，腫瘤抑制組每天胃飼10mg／kg的 AT1R抑制劑0.5ml，觀察裸鼠的成瘤情況，約10天左右成瘤。成瘤后4周后，處死模型鼠，取下腫瘤，部分組織存儲于液氮中備用，部分用10%甲醛固定。

1.2.3 腫瘤形態(tài)學(xué)檢測 自接種第11天起，每兩天測量1次腫瘤的體積（V＝AB2／2），A為腫瘤最大直徑，B為與A垂直的最大徑，將腫瘤體積對時間的變化繪制成腫瘤生長曲線圖。

1.2.4 組織病理觀察 用10%濃度的福爾馬林將剝?nèi)〉哪[瘤組織進行固定、脫水、透明、浸蠟、包埋，成功制成5μm厚的組織切片。用蘇木素－伊紅對組織切片進行染色，然后作腫瘤組織病理學(xué)檢查。

1.2.5 腫瘤血管密度（microvessel density MVD）檢測 MVD計數(shù)參照 Weidner［1］的評判標(biāo)準(zhǔn)。腫瘤組織常規(guī)切片后，每組腫瘤各取一張壞死組織最少、腫瘤細(xì)胞豐富的玻片，先在低倍鏡下尋找內(nèi)皮細(xì)胞染色（CD34染色）最密集的10個區(qū)域（形成微血管最豐富的區(qū)域），在高倍鏡下觀察視野下的組織微血管數(shù)，計算每個視野的數(shù)目，取平均值，即為每個高倍鏡視野下的MVD，胞質(zhì)呈棕黃色染色的內(nèi)皮細(xì)胞簇或單個內(nèi)皮細(xì)胞，與周圍組織有明顯界限，無論有沒有血管腔，血管腔內(nèi)有沒有紅細(xì)胞均定義為1個微血管。若管腔大于8個紅細(xì)胞直徑或管腔有明顯肌層則不在計數(shù)范圍內(nèi)，將兩組的MVD進行比較。

1.2.6 VEGF抗原陽性率的測定 VEGF陽性細(xì)胞判斷以胞漿出現(xiàn)棕黃色團塊或顆粒為準(zhǔn)。高倍鏡下隨機計數(shù)5個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞VEGF染色陽性細(xì)胞數(shù)，5個視野下平均陽性數(shù)作為每一例的陽性數(shù)，用百分?jǐn)?shù)表示。VEGF染色陽性細(xì)胞數(shù)＞30%即為陽性表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，其中，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較應(yīng)用t檢驗，組內(nèi)比較應(yīng)用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠體重和成瘤情況觀察

腫瘤抑制組的腫瘤生長速度明顯慢于腫瘤組的腫瘤生長速度（P＜0.05），見表1、圖1。

表1 裸鼠體重和成瘤情況（）

表1 裸鼠體重和成瘤情況（）

注：與腫瘤組比較△P＜0.01，※P＜0.05。

天數(shù) 組別 體重（g） 平均體積（mm3）15.50±0.46 0腫瘤抑制組 15.71±0.59 0第11天 腫瘤組 17.05±0.28 73.04±10.36腫瘤抑制組 17.75±0.67※ 67.91±10.65※第13天 腫瘤組 18.00±0.43 106.87±16.69腫瘤抑制組 18.84±0.63△ 87.30±10.87△第15天 腫瘤組 18.88±0.35 112.42±16.22腫瘤抑制組 19.68±0.42△ 93.64±10.2△第17天 腫瘤組 19.09±0.34 118.20±16.7腫瘤抑制組 19.93±0.4△ 97.90±11.03△第19天 腫瘤組 19.31±0.36 159.31±14.62腫瘤抑制組 20.21±0.39△ 100.43±11.25△第21天 腫瘤組 19.62±0.32 202.13±16.42腫瘤抑制組 20.71±0.55△ 104.29±10.31△第23天 腫瘤組 19.72±0.34 250.52±24.88腫瘤抑制組 21.55±0.56△ 120.49±13.12△第25天 腫瘤組 19.80±0.27 285.95±25.4腫瘤抑制組 22.1±0.53△ 133.17±12.89△第27天 腫瘤組 19.84±0.22 302.86±24.87腫瘤抑制組 22.26±0.47△ 150.72±13△第29天 腫瘤組 19.90±0.29 322.45±25.93腫瘤抑制組 22.50±0.44△ 167.16±14，8△第31天 腫瘤組 19.85±0.31 382.42±32.82腫瘤抑制組 22.75±0.43△ 187.40±17.24第1天 腫瘤組△

圖1 腫瘤生長曲線圖

兩組模型鼠的平均體重：腫瘤組為19.07g，腫瘤抑制組為21.08g，裸鼠平均10天左右成瘤，直徑均大于5mm，成瘤率為100%（12／12），腫瘤隨著時間的增加而增大，4周后處死模型鼠，移植瘤表面較光滑，毛細(xì)血管豐富。腫瘤大?。耗[瘤組最大徑11.34mm，平均體積210.56mm3，腫瘤抑制組最大徑9.01mm，平均體積119.13mm3，兩組之間有顯著的差異（P＜0.05）。

2.2 腫瘤組織病理學(xué)檢查

光鏡下可以見到腫瘤細(xì)胞呈彌漫分布，核大深染，核呈圓形、卵圓形或形狀不規(guī)則，核染色質(zhì)不均勻，胞質(zhì)少，部分細(xì)胞可見核仁，病理性核分裂多見，組織內(nèi)可見壞死，腫瘤組腫瘤組織內(nèi)見小灶的壞死，大小為1mm－3mm，腫瘤抑制組可見大片狀的壞死約9mm大小，兩組腫瘤組織間質(zhì)血管增生情況見圖2、圖3。腫瘤組內(nèi)可見肌肉內(nèi)癌組織的侵犯，但未見淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，見圖4。

圖2 腫瘤組HE×40 腫瘤組CD34×200 腫瘤組VEGF×200

圖3 腫瘤抑制組 腫瘤抑制組CD34腫瘤抑制組VEGF HE×40 ×200 ×200

2.3 兩組移植瘤腫瘤組織間質(zhì)MVD的比較

用藥組的CD34與VEGF的表達均MVD少于對照組，兩組比較有顯著的差異性（P＜0.05）。見表2。

圖4 腫瘤組肌肉內(nèi)見癌的侵犯

表2 兩組移植瘤腫瘤組織間質(zhì)MVD的比較（）

表2 兩組移植瘤腫瘤組織間質(zhì)MVD的比較（）

CD34 VEGF組別48.59±4.52 46.38±4.31腫瘤抑制組 15.59±3.15 15.42±3.10 t值 59.96 58.75 P值 0.腫瘤組000 0.000

2.4 兩組移植瘤腫瘤組織間質(zhì)VEGF陽性率比較

腫瘤組染色后有5例VEGF陽性，陽性率為83.3%；腫瘤抑制組染色后有1例VEGF陽性，陽性率為16.7%，兩組比較有顯著性差異（P＜0.05）。

3 討論

本研究中成功的建立了HEC－1B人子宮內(nèi)膜癌裸鼠皮下移植瘤模型，此模型在組織病理學(xué)、免疫組化表型都與子宮內(nèi)膜癌癌細(xì)胞相同，而且腫瘤組織移植生長率為100%，這就說明此模型的生物學(xué)特性是穩(wěn)定的，從而為基礎(chǔ)研究提供了非常有價值的動物模型。

大量研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有組織都具有獨立的RAS（腎素－血管緊張素）系統(tǒng)，主要調(diào)節(jié)局部組織的生長和分化［2］。而多數(shù)腫瘤如肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌等組織中都存在局部RAS活性因子的表達上調(diào)，包括 AT1R 表達的上調(diào)［3－8］。我們之前的研究表明從正常子宮內(nèi)膜上皮到非典型增生再到子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展過程中，AT1R表達能力是逐步上調(diào)的，且AT1R的表達與年齡、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況和肌層浸潤深度等因素關(guān)系密切［9］。

我們的實驗證實了AT1R抑制劑對腫瘤的生長有明顯的抑制作用，首先表現(xiàn)在裸鼠的體重方面，應(yīng)用了抑制劑的模型體重明顯比對照組增加；其次表現(xiàn)在移植瘤上，應(yīng)用抑制劑的移植瘤的最大直徑和平均體積均明顯小于對照組；再其次模型中移植瘤的腫瘤細(xì)胞的變化表現(xiàn)在兩個方面，其一，腫瘤細(xì)胞的變性、壞死，抑制劑組的壞死范圍遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組；其二，腫瘤間質(zhì)血管的增生情況，對照組中間質(zhì)血管豐富，明顯增生，而抑制劑組中腫瘤間質(zhì)的血管明顯的減少。從上面的實驗可以得出，AT1R抑制劑對腫瘤生長的抑制作用非常的明顯，主要表現(xiàn)在抑制腫瘤組織間質(zhì)內(nèi)血管的生成，使腫瘤細(xì)胞供血供氧不足，從而腫瘤細(xì)胞壞死，進而起到抑制腫瘤生長的作用，因此AT1R抑制劑在惡性腫瘤的治療方面起著很顯著的作用，至于什么劑量是最合適的劑量，有待我們下一步實驗結(jié)果。

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