SMC1A在腫瘤領(lǐng)域的研究

張一帆，張興義，姜 睿，孫 梅＊

（1.吉林大學(xué)白求恩第二醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130041；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院）

一個(gè)世紀(jì)以前，Boveri曾在研究中觀察到染色體異常與腫瘤發(fā)生相關(guān)，并由此推測(cè)染色體不穩(wěn)定性（chromosome instability，CIN）可介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生［1］。如今隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，人們逐漸意識(shí)到惡性腫瘤具有不同于正常細(xì)胞的一些生物學(xué)特性，例如過(guò)度激活的增殖信號(hào)、抗凋亡途徑以及侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制等。其中染色體不穩(wěn)定性是惡性腫瘤的主要標(biāo)志之一，可以促進(jìn)惡性腫瘤產(chǎn)生一系列生物學(xué)特性，從而在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用［2］。然而迄今為止人們對(duì)細(xì)胞是如何保持基因組穩(wěn)定性以及染色體不穩(wěn)定性在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制卻知之甚少。近年來(lái)科研工作者們開(kāi)展了多項(xiàng)研究試圖深入了解基因組不穩(wěn)定性產(chǎn)生的機(jī)制及其在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的作用，而凝聚蛋白（Cohesin）復(fù)合體的發(fā)現(xiàn)無(wú)疑是該領(lǐng)域新的突破口。Cohesin蛋白復(fù)合體是細(xì)胞維護(hù)染色體穩(wěn)定性的關(guān)鍵因子，而SMC1A作為Cohesin的重要亞基之一，其功能異常被發(fā)現(xiàn)與包括惡性腫瘤在內(nèi)的多種疾病相關(guān)。本文主要對(duì)Cohesin的亞基SMC1A在腫瘤領(lǐng)域的研究進(jìn)展作一綜述。

1 Cohesin的結(jié)構(gòu)

Cohesin蛋白復(fù)合體是一種人類(lèi)進(jìn)化過(guò)程中高度保守的蛋白復(fù)合體，最早發(fā)現(xiàn)于酵母細(xì)胞。該蛋白復(fù)合體含有4個(gè)亞基：即一對(duì)染色體結(jié)構(gòu)維修蛋白（Structural Maintenance of Chromosomes，SMC）SMC1A和SMC3，以及兩個(gè)非SMC蛋白質(zhì)RAD21／SCC1 和 STAG／SCC3／SA 構(gòu) 成。 其 中SMC蛋白SMC1A和SMC3由兩條卷曲螺旋的結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)球狀鉸鏈域構(gòu)成。在Cohesin復(fù)合體中兩個(gè)SMC蛋白的鉸鏈域相互交纏，以此建立一個(gè)反向的異二聚體，而他們的起始域與RAD21蛋白相互作用，共同構(gòu)成一個(gè)封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)。最后，RAD21亞基與SA結(jié)合，形成一個(gè)完整的Cohesin復(fù)合體［3］。Cohesin可以通過(guò)其特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)捕捉DNA，藉此在姊妹染色單體凝聚以及其他細(xì)胞活動(dòng)中執(zhí)行重要功能（圖1）。

圖1 Cohesin結(jié)構(gòu)示意

2 Cohesin的功能

在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中染色體復(fù)制，形成成對(duì)的姊妹染色體。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入分裂中期后，姊妹染色體緊密聚攏在紡錘體赤道，直到末期向兩極準(zhǔn)確分離。同源姊妹染色體的這種彼此聚集作用被稱(chēng)作姊妹染色體凝聚（Sister Chromatid Cohesion，SCC）。在該過(guò)程中Cohesin復(fù)合體可以通過(guò)其環(huán)狀結(jié)構(gòu)把姊妹染色體聚攏在中期紡錘體上，并維持姊妹染色體之間一定的張力，直到分裂末期姊妹染色體分離［4］。Cohesin復(fù)合體在染色體凝聚過(guò)程中的這一功能可以有效防止姊妹染色單體的提前分裂，因此對(duì)維護(hù)子細(xì)胞的染色體穩(wěn)定性有著重要意義［5］。雖然已有多個(gè)針對(duì)Cohesin在細(xì)胞分裂中的作用模式被相繼提出［6－8］，但迄今為止Cohesin蛋白在細(xì)胞分裂過(guò)程中的作用機(jī)制并未得到完全闡明。目前普遍認(rèn)為Cohesin在有絲分裂過(guò)程中發(fā)揮其功能依賴(lài)多個(gè)Cohesin相關(guān)蛋白的協(xié)調(diào)作用。例如在酵母細(xì)胞的G1期或在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的前一個(gè)細(xì)胞周期的末期，輔助因子NIPBL便開(kāi)始介導(dǎo)Cohesin裝配在染色體上。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入S復(fù)制期后，Eco1／Ctf7介導(dǎo)的SMC3乙酰化可以維持Cohesin穩(wěn)定地固著在染色體上［9］。而姊妹染色體的準(zhǔn)確配對(duì)和維持則有賴(lài)于PDS5與Cohesin蛋白復(fù)合體之間的相互作用［10］。細(xì)胞由分裂中期向后期過(guò)渡受到中／后期關(guān)卡（checkpoint）嚴(yán)格調(diào)控。只有當(dāng)所有姊妹染色體在紡錘體內(nèi)準(zhǔn)確的向兩極分離時(shí)，APC／C復(fù)合體（Anaphase Promoting Complex／Cyclosome）抑制中／后期關(guān)卡，推動(dòng)細(xì)胞周期向后期過(guò)渡。在細(xì)胞分裂后期，Cohesin的亞基 RAD21和SA1／SA2被Polo－like激酶1（PLK1）磷酸化，環(huán)狀結(jié)構(gòu)被打開(kāi)，使固著在染色體臂上的Cohesin逐步脫落下來(lái)。但聚集在著絲粒區(qū)域內(nèi)的Cohesin仍受到SGO1的保護(hù)［11］。此外Cohesin從染色體上脫離還需要 WAPL因子與RAD21及SA1直接作用［12］。最后由APC／C復(fù)合體降解PTTG1，促使ESPL1（裂解酶）切斷RAD21，從而使著絲粒上的Cohesin徹底從染色質(zhì)中脫落下來(lái)［13］。Cohesin在細(xì)胞分裂周期中的功能很好的為我們揭示了細(xì)胞分裂過(guò)程中姊妹染色體是如何緊密相連以及準(zhǔn)確分離。然而在細(xì)胞分裂期結(jié)束后仍有部分Cohesin復(fù)合體以環(huán)狀結(jié)構(gòu)殘留在細(xì)胞內(nèi)甚或被重新裝配在染色體上［14］，令人們不禁推測(cè)Cohesin除了在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用，還履行著其他的功能（圖2）。

圖2 Cohesin在細(xì)胞周期中的作用模式

當(dāng)細(xì)胞暴露于電離輻射致其內(nèi)部的DNA雙鏈斷裂時(shí)，其斷裂的DNA若得不到正確的修復(fù)則會(huì)引起基因的插入，缺失以及易位，嚴(yán)重影響染色體穩(wěn)定性，最終可能誘發(fā)腫瘤。目前已有研究發(fā)現(xiàn)Cohesin復(fù)合體在細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制中發(fā)揮重要功能。如在芽植酵母中，當(dāng)細(xì)胞暴露于γ射線導(dǎo)致其內(nèi)部發(fā)生DNA雙鏈斷裂時(shí)，Cohesin復(fù)合體可以通過(guò)染色體凝聚作用使姊妹染色體彼此靠近，協(xié)助DNA修復(fù)相關(guān)因子以未發(fā)生斷裂的染色體為模板，修復(fù)其斷裂的位點(diǎn)［15］。而且在人體細(xì)胞內(nèi)Cohesin復(fù)合體常聚集在DNA雙鏈斷裂后重建連接的區(qū)域［16］。Cohesin在該區(qū)域內(nèi)的聚集不僅能在DNA發(fā)生損傷后維護(hù)DNA的構(gòu)象以利于修復(fù)相關(guān)酶的附著，還可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中通過(guò)募集細(xì)胞關(guān)卡相關(guān)蛋白，調(diào)控細(xì)胞周期，調(diào)控受損DNA的修復(fù)［17］。由此可見(jiàn)，Cohesin對(duì)細(xì)胞DNA修復(fù)及維護(hù)染色體穩(wěn)定性等方面具有重要作用。

如上文所述，在細(xì)胞分裂后期Cohesin的亞基RAD21可以被ESPL1溶蛋白性裂解，使環(huán)狀結(jié)構(gòu)解開(kāi)，利于姊妹染色體的分離。有趣的是，研究者們?cè)诩?xì)胞凋亡過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)了RAD21蛋白的裂解［18］，但RAD21蛋白在凋亡中的裂解位點(diǎn)不同于在姊妹染色體凝聚過(guò)程中的裂解位點(diǎn)，其裂解過(guò)程往往發(fā)生在凋亡早期，為非P53依賴(lài)性凋亡，而其裂解后的產(chǎn)物以正向反饋機(jī)制促進(jìn)凋亡［19］。這些結(jié)果提示Cohesin復(fù)合體參與細(xì)胞非P53凋亡途徑，但其在該凋亡信號(hào)通路中的具體機(jī)制尚不清楚。

Cohesin可以與鋅指蛋白CTCF相互作用，從而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞印記調(diào)控中執(zhí)行重要功能。目前研究已證實(shí)鋅指蛋白CTCF可以調(diào)控多個(gè)印記位點(diǎn)，其中對(duì) H19／IGF2基因的印記調(diào)控最具代表性。H19為父源性基因，而IGF2為母源性基因。Cohesin和CTCF蛋白相互作用后，CTCF一方面可以結(jié)合在H19的印記調(diào)控區(qū)域促進(jìn)其表達(dá)，另一方面通過(guò)抑制IGF2的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子阻斷IGF2基因的表達(dá)。反之亦然。鋅指蛋白CTCF在H19／IGF2基因印記中這一功能需Cohesin蛋白的參與［20］。

除此之外，Cohesin復(fù)合體與鋅指蛋白CTCF相結(jié)合以后錨定在染色體上，促使染色體形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄［21］。目前已知Cohesin蛋白及CTCF鋅指蛋白可以結(jié)合在多種基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)［22］。在果蠅細(xì)胞的研究中人們還發(fā)現(xiàn)Cohesin相關(guān)蛋白Nipped－B可以通過(guò)遠(yuǎn)端增強(qiáng)子的調(diào)節(jié)促進(jìn)其下游基因cut的表達(dá)［23］。

綜上所述，Cohesin復(fù)合體不僅在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中維護(hù)姊妹染色單體的配對(duì)及準(zhǔn)確分離，保證子細(xì)胞的基因組穩(wěn)定性，還在DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡、基因印記調(diào)控以及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多項(xiàng)細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮重要功能。由此我們不難想象Cohesin復(fù)合體的功能缺陷在人體中引起包括惡性腫瘤在內(nèi)的多種疾病。

3 Cohesin蛋白復(fù)合體與惡性腫瘤

目前人們已觀察到大多數(shù)癌細(xì)胞都展現(xiàn)出染色體不穩(wěn)定性，而Cohesin蛋白復(fù)合體自從被發(fā)現(xiàn)以來(lái)一直被認(rèn)為是維護(hù)染色體穩(wěn)定性的關(guān)鍵因子。近年來(lái)越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)研究致力于闡釋Cohesin蛋白及其輔助因子的功能缺陷與人類(lèi)惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。Barber等在表現(xiàn)為染色體不穩(wěn)定性的結(jié)腸癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)包括SMC1A，SMC3，SA3和NIPBL在內(nèi)多個(gè)Cohesin相關(guān)基因的突變致其編碼蛋白表達(dá)受阻［24］。除了突變之外，Cohesin相關(guān)基因的表達(dá)異常也在多種人類(lèi)癌癥中被觀察到。例如RAD21基因在前列腺癌中高表達(dá)［25］，而且該基因在乳腺癌中其表達(dá)水平與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)［26］。此外人們還在宮頸癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)WAPL基因的高表達(dá)可以促進(jìn)癌細(xì)胞增殖及侵襲［27］，裂解酶的編碼基因ESPL1的高表達(dá)在乳腺癌和前列腺癌中均提示預(yù)后不良［28］。而RAD21在口腔鱗癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)可以增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力［29］。在胚胎細(xì)胞中PDS5B的表達(dá)缺失則可以誘發(fā)胚胎性癌［30］。這些實(shí)驗(yàn)證據(jù)足以表明Cohesin的功能缺陷與腫瘤發(fā)生具有一定的相關(guān)性。然而這些基因的表達(dá)失控與腫瘤發(fā)生的關(guān)系顯得復(fù)雜多樣。Cohesin復(fù)合體在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制仍是現(xiàn)階段函待解決的熱點(diǎn)問(wèn)題。

如上文所述，Cohesin蛋白復(fù)合體通過(guò)其在分裂周期中的經(jīng)典模式維護(hù)細(xì)胞的染色體穩(wěn)定性。而該功能的缺陷可以導(dǎo)致姊妹染色單體的分離及子細(xì)胞內(nèi)的染色體數(shù)量異常，最終影響基因的表達(dá)，例如染色體缺失可以引起某些抑癌基因的丟失。若這些抑癌基因的等位基因處于失活狀態(tài)，則有可能引起細(xì)胞異常增殖甚至腫瘤的發(fā)生。同理，染色體異常增多所致癌基因的激活亦可介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。如惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中10號(hào)染色體以單體形式存在可以導(dǎo)致抑癌基因PTEN的失活而在腎癌細(xì)胞中7號(hào)染色體的三體形式則會(huì)引起癌基因MET的過(guò)表達(dá)。不過(guò)人們?cè)谡ＤI組織細(xì)胞中也觀察到7號(hào)染色體的三體形式，因此關(guān)于其是否與腎癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)尚存在較多爭(zhēng)議。有趣的是，Kudhson提出的兩次突變學(xué)說(shuō)認(rèn)為腫瘤的發(fā)生源于兩次抑癌基因的突變，而目前已有學(xué)者提出其中一次突變可能來(lái)源于Cohesin蛋白的功能缺陷［31］。除此之外，Cohesin與CTCF結(jié)合后可以調(diào)控多種不同基因的細(xì)胞印記，其中H19／IGF2基因印記的調(diào)控已被廣泛地研究。在宮頸癌Hela細(xì)胞系里RAD21基因的缺失可以引起H19／IGF2基因的印記調(diào)控異常。IGF2印記失控也發(fā)生在約90% 腎母細(xì)胞瘤以及其他惡性腫瘤中如肺癌，宮頸癌，橫紋肌肉瘤和睪丸癌等［32－34］。

綜上所述，Cohesin蛋白復(fù)合體不僅憑借其環(huán)狀結(jié)構(gòu)在細(xì)胞有絲分裂中發(fā)揮重要功能，而且還廣泛參與DNA修復(fù)，細(xì)胞周期，基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及基因組印記等細(xì)胞生命活動(dòng)，藉此維護(hù)細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性。而突變及其他因素所致Cohesin復(fù)合體的功能缺陷往往會(huì)伴有染色體結(jié)構(gòu)及數(shù)量的異常和細(xì)胞周期失控，導(dǎo)致細(xì)胞基因組穩(wěn)定性遭到破壞，從而介導(dǎo)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。而作為其重要的部件之一SMC1A基因的異常表達(dá)也在多種人類(lèi)惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)。

4 SMC1A的功能

在人類(lèi)細(xì)胞內(nèi)SMC1A基因位于性染色體11.22至11.21區(qū)域內(nèi)含有25個(gè)外顯子，負(fù)責(zé)編碼Cohesin復(fù)合體的重要部件之一SMC1A蛋白。人們?cè)谘芯緾ornelia de Lange Syndrome（CdLS）時(shí)驚奇的發(fā)現(xiàn)這種先天性綜合征與Cohesin的功能缺陷密切相關(guān)，其中約5%的CdLS患者顯示SMC1A的突變。雖然該基因的突變僅存在于一小部分CdLS患者中，但這足以說(shuō)明SMC1A基因的異?？梢詫?dǎo)致胚胎細(xì)胞的染色體不穩(wěn)定并造成嚴(yán)重的先天性發(fā)育缺陷。此外SMC1A被認(rèn)為與胚胎干細(xì)胞的自我更新能力密切相關(guān)，利用RNAi技術(shù)下調(diào)SMC1A的表達(dá)可以削弱胚胎干細(xì)胞的自我更新能力［35］。

如上文中所述，作為Cohesin蛋白復(fù)合體亞基SMC1A與SMC3及RAD21蛋白共同構(gòu)成一個(gè)封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在姊妹染色體凝聚中發(fā)揮重要功能。除此之外，人們很早就觀察到SMC1A還是某些ATM／ATR蛋白激酶的底物。當(dāng)細(xì)胞暴露于電離輻射導(dǎo)致其內(nèi)部DNA損傷后，SMC1A蛋白957和966位點(diǎn)的絲氨酸殘端被ATM磷酸化，通過(guò)NBS1和BRCA蛋白的募集作用使ATM蛋白激酶聚集在損傷部位，促進(jìn) DNA損傷的修復(fù)［36，37］。在電離輻射后的鼠類(lèi)細(xì)胞中SMC1A基因若發(fā)生突變導(dǎo)致其編碼蛋白不能被磷酸化，則會(huì)引起細(xì)胞的DNA修復(fù)能力明顯減弱，其生存率下降［38］。而且在人類(lèi)纖維細(xì)胞中運(yùn)用RNAi技術(shù)同時(shí)敲除SMC1A和SMC3則會(huì)引起細(xì)胞染色體非整倍體等異常，尤以基因組脆性位點(diǎn)變化顯著［39］。由此可見(jiàn)，SMC1A在細(xì)胞DNA修復(fù)機(jī)制中起到關(guān)鍵作用，其功能異?？梢詫?dǎo)致細(xì)胞DNA修復(fù)障礙，進(jìn)而引起嚴(yán)重后果。

最近人們還在去鐵草酰胺介導(dǎo)的凋亡過(guò)程中觀察到SMC1A被ATR磷酸化，表明SMC1A亦參與該類(lèi)凋亡［40］。

此外，Cohesin的亞基RAD21和SMC1還可以和鋅指蛋白CTCF共同作用于哺乳動(dòng)物c－myc基因的啟動(dòng)子序列及H19／Igf2印記調(diào)控區(qū)域，從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄以及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)［41］。

5 SMC1A與腫瘤

雖然SMC1A在腫瘤發(fā)生中的機(jī)制目前尚未得到充分闡明，但已有實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)SMC1A的表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

在急性髓細(xì)胞樣白血病的研究中人們發(fā)現(xiàn)SMC1A基因的表達(dá)與患者年齡呈負(fù)性相關(guān)，而且其編碼蛋白的表達(dá)水平與患者的預(yù)后成正相關(guān)［42］。如上文所述，SMC1A在維護(hù)染色體穩(wěn)定等方面有著重要功能作用，但在該項(xiàng)研究中人們并未觀察到SMC1A的表達(dá)異常引起染色體不穩(wěn)定及其他明顯的染色體異常等情況的出現(xiàn)。SMC1A在急性髓細(xì)胞樣白血病發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步深入的探究。

結(jié)直腸癌細(xì)胞往往表現(xiàn)出基因組不穩(wěn)定，但其具體機(jī)制一直以來(lái)未得到闡明。最近Barber等人在研究結(jié)腸癌時(shí)發(fā)現(xiàn)132例結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)有11種基因突變，而SMC1A的突變就占了其中4種，并且均為錯(cuò)義突變。該基因的錯(cuò)義突變可形成提前終止密碼子或者讀碼框的移動(dòng)，使其編碼蛋白合成受阻，表達(dá)下調(diào)。為了驗(yàn)證這些基因與腫瘤發(fā)生的作用，研究者們應(yīng)用siRNA技術(shù)下調(diào)SMC1A，SMC3和SCC的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這些基因的敲除可導(dǎo)致正常細(xì)胞姊妹染色單體凝聚功能障礙以及染色體不穩(wěn)定，提示這些Cohesin相關(guān)基因可能是引起結(jié)腸癌細(xì)胞中染色體不穩(wěn)定的靶基因，其表達(dá)受阻可影響細(xì)胞的染色體穩(wěn)定性并促使腫瘤的發(fā)生［24］。

此外，馮婉婷等人發(fā)現(xiàn)慢病毒介導(dǎo)RNAi沉默結(jié)直腸癌細(xì)胞的SMC1A基因可以引起癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性顯著增加［43］，提示SMC1A的表達(dá)與癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性相關(guān)。

但到目前為止SMC1A的調(diào)控異常在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的作用尚存較多爭(zhēng)議。例如SMC1A的突變所造成的Cohesin功能缺陷與CdLS的發(fā)病呈一定的相關(guān)性，但大多數(shù)CdLS的患者并不伴有癌癥發(fā)生。有關(guān)SMC1A的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定是否發(fā)生在其他惡性腫瘤細(xì)胞中，SMC1A在不同腫瘤發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制及其是否與姊妹染色單體凝聚功能缺陷以及染色體不穩(wěn)定相關(guān)，SMC1A在不同腫瘤中的表達(dá)水平是否決定抗癌療效并與預(yù)后相關(guān)等等這些問(wèn)題都需要進(jìn)一步的研究探索和驗(yàn)證。

綜上所述Cohesin的功能缺陷在腫瘤領(lǐng)域是一個(gè)新興的分子機(jī)制，其在DNA修復(fù)，細(xì)胞周期和基因表達(dá)調(diào)控和基因組印記調(diào)控等過(guò)程中的重要作用目前受到了學(xué)界的廣泛關(guān)注。而SMC1A作為Cohesin復(fù)合體的重要亞基，參與到多種細(xì)胞活動(dòng)中，其突變及調(diào)控異常往往會(huì)引起基因組的不穩(wěn)定，并有可能促成癌癥的發(fā)生發(fā)展。因此Cohesin復(fù)合體及其亞基SMC1A的深入研究有望為我們研究腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制開(kāi)辟出新的途徑，從而為腫瘤的早期診斷以及個(gè)體化靶向治療的臨床應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)。

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