基因芯片技術(shù)及其在結(jié)核分枝桿菌檢測中的應(yīng)用

榮愛紅，趙蓬波，侯曉杰

（吉林省人民醫(yī)院，吉林 長春130021）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種慢性傳染病，主要侵犯肺臟。在某些經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)，許多結(jié)核病患者因為得不到全程，合理的救治而產(chǎn)生結(jié)核耐藥，這使得控制結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展成為世界性問題。目前，臨床實驗室采用的檢測結(jié)核分枝桿菌的方法主要有抗酸染色法和細(xì)菌培養(yǎng)法?？顾崛旧ê啽?、實用、快捷，但非結(jié)核性分枝桿菌亦可出現(xiàn)陽性結(jié)果；細(xì)菌培養(yǎng)作為結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，雖優(yōu)于抗酸染色法，但時間比較長，影響早期用藥；熒光染色和PCR是可供選擇的檢測方法，卻可能出現(xiàn)假陽性和假陰性；而依賴于基因芯片的PCR雜交法敏感性和特異性均高，是比較準(zhǔn)確的檢測方法［1］。

1 基因芯片

基因芯片（gene chip）技術(shù)是隨著“人類基因組計劃”（human genome project，HGP）的進(jìn)展而發(fā)展起來的，它是21世紀(jì)以來影響最深遠(yuǎn)的重大科技進(jìn)展之一，是物理學(xué)、微電子學(xué)與分子生物學(xué)綜合交叉形成的高新技術(shù)。

1.1 基因芯片的概念

基因是指具有遺傳效應(yīng)的DNA片段，位于細(xì)胞的染色體上。我們將大量的基因片段按一定的順序固定在特定的載體上，即為基因芯片。在一塊約1cm2大小的芯片上，可固定數(shù)千甚至上萬的基因片段，由此形成一個密集的基因方陣，方便對多個基因進(jìn)行同步檢測［2］。

1.2 基因芯片的優(yōu)點

基因芯片作為一種先進(jìn)的、大規(guī)模、高通量的檢測技術(shù)，正逐步成為疾病診斷的尖端技術(shù)之一［3］，其優(yōu)點主要表現(xiàn)在：一，靈敏性和準(zhǔn)確性；二，快捷簡便性；三，同步性。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，醫(yī)生針對多種相似病原菌進(jìn)行鑒別診斷時，若能應(yīng)用基因芯片技術(shù)，則短時間內(nèi)就能知道病人是哪種微生物感染，這對指導(dǎo)臨床合理，及時，準(zhǔn)確的用藥提供了很大的方便。

1.3 基因芯片的分類［4］

基因芯片有多種分類方法：

1.3.1 按基因芯片所用載體材料分：玻璃芯片，硅芯片，陶瓷芯片；其中，玻璃芯片較常見。

1.3.2 按芯片點樣方式的不同分：原位合成芯片，微距陣芯片，電定位芯片。

1.3.3 按基因芯片用途分為：表達(dá)譜芯片，診斷芯片，指紋圖譜芯片，測序芯片等。

1.4 基因芯片的用途

基因芯片技術(shù)的準(zhǔn)確靈敏性，同步性，所需樣本少，污染少的特點，使其不僅在疾病檢測方面有廣泛應(yīng)用，在法醫(yī)學(xué)鑒定，藥物篩選方面及環(huán)境科學(xué)方面同樣有重要的使用價值。

1.4.1 疾病檢測診斷方面，基因芯片只需少量標(biāo)本，在短時間內(nèi)，即可對所需鑒別的疾病進(jìn)行同步化檢測，不僅能幫助醫(yī)生盡早做出診斷，還能減輕病人的痛苦，一舉兩得。

1.4.2 法醫(yī)學(xué)方面，基因芯片優(yōu)于早先的DNA指紋鑒定［5］，將這些具有遺傳效應(yīng)的基因片段分析處理后，可以更準(zhǔn)確的推斷生命體的特征，常被應(yīng)用于尸體鑒定及親子鑒定。

1.4.3 藥物篩選方面［6］，基因芯片通過分析用藥前后機體基因表達(dá)譜的改變，來判斷藥物的療效，省時省力又準(zhǔn)確。

1.4.4 環(huán)境科學(xué)方面，目前，基因芯片已經(jīng)應(yīng)用于［7］土壤中微生物的檢測，水中病原菌及毒物鑒定，如果應(yīng)用恰當(dāng)?shù)脑?，可以解決人類日常生活中不少問題，使人們的生活水平得到提高。

1.5 基因芯片的原理

基因芯片是將已知核酸序列的DNA，固定在某種載體上，然后與待測樣品中的DNA或RNA，按照堿基互補配對原則進(jìn)行雜交，再經(jīng)過特定計算機軟件的處理，獲得待測樣品的信息。如果待測樣本為RNA，一般先經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄過程，形成RNA－DNA雜交體，經(jīng)RNA酶的水解，變?yōu)閱捂淒NA，再與已知的探針進(jìn)行雜交［8］。

1.6 基因芯片技術(shù)的主要技術(shù)環(huán)節(jié)

基因芯片主要包括4個基本技術(shù)環(huán)節(jié)［9，10］：1.芯片制備；2.樣品制備；3.分子之間相互反應(yīng)；4.反應(yīng)結(jié)果的檢測及分析。

1.6.1 芯片制備 目前，芯片的制備主要采用的載體有玻璃片或硅膠片，再將DNA、RNA片段或蛋白質(zhì)分子按一定順序排列在載體上，形成芯片。

1.6.2 樣品制備 樣品的制備和處理是該技術(shù)的第2個重要環(huán)節(jié)。我們所接觸的樣品都是復(fù)雜的生物分子混合體，一般不能直接與基因芯片進(jìn)行反應(yīng)。因此，需要將這些混合體進(jìn)行特定的生物處理，以獲取所需的DNA、RNA片段或蛋白質(zhì)分子等，并加以標(biāo)記，以提高檢測的靈敏度。

1.6.3 分子之間相互反應(yīng) 此反應(yīng)是芯片檢測的關(guān)鍵一步。為了使反應(yīng)更加精確，通常需要人為地調(diào)節(jié)反應(yīng)所需的最適環(huán)境，以減少錯配率，從而獲取最能反映生物本質(zhì)的信號。

1.6.4 反應(yīng)結(jié)果的檢測及分析 目前，芯片信號檢測方法是應(yīng)用芯片掃描儀，通過采集各反應(yīng)點的熒光強弱和熒光位置，經(jīng)過軟件分析，即可以獲得相關(guān)的生物信息。

1.7 基因芯片的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀［11］

鑒于基因芯片的諸多優(yōu)點，世界上的許多國家和地區(qū)都已著手進(jìn)行基因芯片的研制和開發(fā)，美國政府于1998年正式啟動基因芯片計劃，國立衛(wèi)生研究院（NIH）、能源部、中央情報局等均參與了此項目。同時斯坦福大學(xué)、麻省理工學(xué)院及部分國立實驗室如Argonne，Oakridge也參與了該項目的研究和開發(fā)。英國劍橋大學(xué)、歐亞公司也正在從事該領(lǐng)域的研究。世界大型制藥公司對基因芯片技術(shù)用于基因多態(tài)性、疾病相關(guān)性、基因藥物開發(fā)和合成或天然藥物篩選等領(lǐng)域感興趣，也已建立或正在建立自己的芯片設(shè)備和技術(shù)設(shè)備。

我國人口眾多，有著豐富的基因資源，由于所有疾病和遺傳信息都與基因有著密切的聯(lián)系，因此基因研究具有特別重要的價值，基因芯片技術(shù)的發(fā)展將大大促進(jìn)我國的人類基因組計劃的進(jìn)程。目前國內(nèi)掀起基因芯片的研究熱潮，聯(lián)合基因科技集團(tuán)有限公司成功地制作了國內(nèi)第一塊基因表達(dá)譜芯片和HCV診斷芯片，并通過了由上海市科委組織的專家鑒定，標(biāo)志著我國的芯片研究已跟上國際同行發(fā)展的步伐，走向產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。

2 基因芯片在結(jié)核分枝桿菌中的應(yīng)用

2.1 基因芯片對結(jié)核分枝桿菌耐藥性的研究

基因芯片對結(jié)核分枝桿菌的研究一經(jīng)報道，立即引起了國內(nèi)外學(xué)者的高度重視，成為［12，13］本世紀(jì)分子生物學(xué)的研究熱點。在結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測方面，芯片技術(shù)可將所有突變的探針固定到一張芯片上，只須一次雜交，即可獲得某一菌株對所有藥物的敏感性結(jié)果，因而對指導(dǎo)醫(yī)生合理用藥非常有價值，并為控制疾病的傳播提供了可能性［14］。

2.1.1 1998年，Gingeras等［12］利用結(jié)核分枝桿菌rpoB基因保守區(qū)705bp特異核苷酸序列探針與基因芯片雜交，對10種121株分枝桿菌進(jìn)行基因分型與菌種鑒定。作者用rpoB寡核苷酸芯片技術(shù)與常規(guī)雙脫氧核苷酸測序方法，分析了10種分支桿菌種間與種內(nèi)的序列多樣性，并確證了幾種特異性單堿基多態(tài)性。

2.1.2 1999年 Troesch等［15］基于16SrRNA 和rpoB基因序列，利用基因芯片技術(shù)鑒定出70株27種不同菌種的分枝桿菌臨床分離株和15株耐利福平菌株，結(jié)果正確地鑒定了27個種屬中的26個，而且檢測出了所有耐利福平的15株結(jié)核分枝桿菌rpoB突變基因。

2.1.3 2002年張萬江等［16］報道應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測1株結(jié)核分枝桿菌藥物敏感株和4株耐多藥株結(jié)核分枝桿菌，基因芯片掃描結(jié)果經(jīng)分析與傳統(tǒng)藥敏檢測結(jié)果相符合。

2.1.4 2003年崔振玲等用［17］芯片檢測耐異煙肼分離株katG、ahpC調(diào)節(jié)區(qū)域和inhA調(diào)節(jié)區(qū)域的基因突變。同年，端木和運等［18］報道應(yīng)用基因芯片檢測20株耐INH、RFP結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的katG、rpoB基因突變；李胡渤等用 DNA［19］芯片對59株耐藥結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行耐異煙肼、耐利福平基因進(jìn)行檢測。

2.2 基因芯片技術(shù)應(yīng)用于耐多藥結(jié)核?。∕DRTB）檢測的現(xiàn)狀

至今為止，經(jīng)過各國科研工作者的共同努力，已經(jīng)鑒定出的結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因如下表1［20－24］。

表1 結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因

3 展望

盡管基因芯片技術(shù)發(fā)展的時間還不長，在各個科學(xué)領(lǐng)域還未廣泛深入，應(yīng)用過程中存在這樣那樣不可預(yù)知的問題，但由于其自身的諸多特性，使得這項技術(shù)有著巨大的潛能，相信隨著科學(xué)工作者不斷的追求和探索，基因芯片技術(shù)一定會在生命科學(xué)研究領(lǐng)域創(chuàng)造輝煌的成就。

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