實(shí)時(shí)熒光PCR法與流式細(xì)胞術(shù)兩種方法檢測HLA－B27的比較

陳慧毅，褚為靖，張會英＊，葛艷玲，張 茜

（1.北京積水潭醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京100035；2.衛(wèi)生部北京醫(yī)院 檢驗(yàn)科）

人類白細(xì)胞抗原（HLA）是一組位于人體細(xì)胞膜表面能夠識別“自己”或“非己”的抗原分子，由位于人類6號染色體短臂上的一組主要組織相容性復(fù)合體基因（MCH）編碼。這些基因包括很多基因座位，例如：HLA－A，HLA－B，HLA－DR等，每個(gè)基因座位包括很多等位基因。其中HLA－B27是HLAB基因座位上的一個(gè)重要的等位基因?，F(xiàn)在研究表明HLA－B27與強(qiáng)直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis，AS）具有高度的相關(guān)性［1］。Brown等［2］報(bào)道AS患者中，HLA－B27抗原呈陽性者高達(dá)94%，而健康人群僅為9%。因此，HLA－B27檢測已經(jīng)成為臨床上支持AS診斷的重要依據(jù)。檢測HLA－B27的方法有多種，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室常采用的有：微量細(xì)胞毒試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫方法、流式細(xì)胞儀檢測法、PCR法等。以PCR為基礎(chǔ)的多種分子生物學(xué)技術(shù)被用于檢測 HLA－B27基因型，如 PCR－RFLP、PCR－SSP、PCR－SSO和PCR－LBT等，這些方法都需要在PCR后進(jìn)行凝膠電泳，而且使用強(qiáng)誘變劑EB為染料，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且容易造成污染而出現(xiàn)假陽性結(jié)果，使這些PCR方法的應(yīng)用受到一定的限制。實(shí)時(shí)熒光PCR是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的新型核酸檢測技術(shù)，此法將先進(jìn)的光學(xué)設(shè)備、溫控技術(shù)、熒光素標(biāo)記技術(shù)、核酸擴(kuò)增技術(shù)以及計(jì)算機(jī)軟件有機(jī)地結(jié)合起來，能夠?qū)CR每一循環(huán)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測，故稱為實(shí)時(shí)熒光PCR。本研究采用實(shí)時(shí)熒光PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測HLA－B27，比較兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 2010年8月至2011年3月北京積水潭醫(yī)院門診或住院患者138例，其中男85例，女53例。對收集到的138例外周靜脈血同時(shí)采用熒光PCR染料法和流式細(xì)胞術(shù)檢測HLA－B27。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 流式細(xì)胞儀（EPICS－XL）和樣品制備儀（EPICS Immunology Workstation，Coulter Q－prep）購于美國貝克曼庫爾特公司。流式細(xì)胞儀檢測用試劑，異硫氰酸熒光素／藻紅蛋白（FITC／PE）標(biāo) 記 的 HLA－B27／HLA－B7 單 克 隆 抗 體、IgG1－FITC／IgG2a－PE 和 CD4－FITC／CD8－PE 熒 光抗 體購于法國Immunotech公司；熒光校準(zhǔn)微球（Flow Check）及樣品制備試劑（ImmunoPrep Reagent System）購于美國貝克曼庫爾特公司。

1.2.2 PCR擴(kuò)增儀（Roche LightCycler 480），微型高速離心機(jī)（Microfuge 22Rcentrifuge）購于美國貝克曼庫爾特公司，恒溫金屬?。℉B－100）購于杭州博日科技有限公司，血液基因組DNA提取試劑盒購于天根公司，HLA－B27熒光PCR基因檢測試劑盒購于博奧生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測人類白細(xì)胞抗原HLA－B27的步驟

（1）血樣采集：空腹抽取靜脈血2ml，EDTA－K3（乙二胺四乙酸三鉀）抗凝。（2）細(xì)胞熒光染色：取3支流式細(xì)胞儀專用試管，分別標(biāo)注對照管、補(bǔ)償管和患者血樣管。對照管加IgG1－FITC／IgG2a－PE熒光抗體10μl，補(bǔ)償管加CD4－FITC／CD8－PE熒光抗體10μl，患者血樣管加 HLA－B27－FITC／HLA－B7－PE熒光抗體10μl。然后分別在3支試管中加入患者EDTA抗凝全血各100μl，輕輕混勻。室溫避光保存15－20min。（3）樣品制備：使用樣品制備儀進(jìn)行溶血和固定。（4）洗滌和離心：將制備樣品管放置離心機(jī)內(nèi)，580×g離心5min；離心后棄上清液。向含沉淀細(xì)胞的試管中加入pH值為7.2的PBS液1 ml，混勻。580×g再次離心5min，棄上清液，再次向含沉淀細(xì)胞的試管中加入pH值為7.2的PBS液1ml，混勻備用。（5）流式細(xì)胞儀檢測：上機(jī)檢測前，用熒光校準(zhǔn)微球校正流式細(xì)胞儀光路和流路，使變異系數(shù)值（CV）在2.0之內(nèi)。建立并選定流式細(xì)胞儀檢測HLA－B27的方案。將對照管插入儀器的進(jìn)樣口，找出3組細(xì)胞，選擇1個(gè)細(xì)胞群，調(diào)節(jié)確定合適的放大電壓。將補(bǔ)償管插入儀器的進(jìn)樣口，調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償。將患者血樣管插入儀器進(jìn)樣口，當(dāng)標(biāo)本的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)＞5 000時(shí)，根據(jù)HLA－B27細(xì)胞數(shù)表達(dá)的百分比和平均熒光強(qiáng)度判斷檢測結(jié)果。（6）結(jié)果判斷HLA－B27陽性結(jié)果判斷方法為：B27表達(dá)的細(xì)胞數(shù)＞90%和平均熒光強(qiáng)度＞8。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測人類白細(xì)胞抗原HLA－B27步驟

（1）血樣采集：空腹抽取靜脈血2ml，乙二胺四乙酸三鉀（EDTA－K3）抗凝。（2）提取基因組：取血液樣本500μl，放入1.5ml離心管中，加入1ml的細(xì)胞裂解液，顛倒混勻，1 1500×g離心1min，棄去上清，留下細(xì)胞核沉淀。向離心收集到的細(xì)胞核沉淀中加入200μl緩沖液GS，再加入20μl蛋白酶K溶液和200μl緩沖液GB，充分顛倒混勻，56℃放置15分鐘，直至溶液變清亮。加入200μl無水乙醇，充分顛倒混勻。將上述所得溶液加入到吸附柱中，13 400×g離心30s，棄去收集管中廢液。向吸附柱中加入500μl緩沖液GD，13 400×g離心30s，棄去收集管中廢液。向吸附柱中加入700μl漂洗液，13 400×g離心30s，棄去收集管中廢液。向吸附柱中加入500μl漂洗液，13 400×g離心30s，棄去收集管中廢液。將吸附柱放回收集管，13 400×g離心2min，倒掉廢液。將吸附柱置于室溫放置15 min，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。將吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，滴加50μl洗脫緩沖液TB，室溫放置3min，13 400×g離心2min，將基因組收集到離心管中。（3）基因擴(kuò)增：從試劑盒中取出PCR反應(yīng)液，室溫融化。分別向裝有PCR反應(yīng)液的管中加入1μl模板，蓋緊管蓋，置于PCR儀上按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增。基因擴(kuò)增程序：37℃600s，1個(gè)循環(huán)；96℃ 900s，1個(gè)循環(huán)；96℃ 25s，62℃30s，72℃30s，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析程序：95℃10s；72℃10s；95℃10s；50℃10s。（4）結(jié)果判讀：當(dāng)質(zhì)控峰與B27峰在目標(biāo)溫度區(qū)間的熒光信號最大值的比值小于等于2.925，此樣本為陽性標(biāo)本。當(dāng)質(zhì)控峰與B27峰在目標(biāo)溫度區(qū)間的熒光信號最大值的比值大于2.925，此樣本為陰性標(biāo)本。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，2種檢測方法檢出陽性率比較采用配對χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測兩種方法同時(shí)檢測 檢測結(jié)果見表1。共檢測138例患者（男性85例，女性53例），流式細(xì)胞術(shù)檢出陽性為36例，實(shí)時(shí)熒光PCR法檢出陽性為39例，經(jīng)配對χ2＝1.33，兩種方法的檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。2種方法符合率為97.8%（135／138），見表1。

表1 兩種方法同時(shí)檢測結(jié)果比較

2.2 流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測HLAB27同時(shí)檢測出的陰性標(biāo)本如圖1所示，它們同時(shí)檢測出的陽性標(biāo)本如圖2所示。

圖1 陰性標(biāo)本

圖2 陽性標(biāo)本

2.3 在流式細(xì)胞術(shù)檢測HLA－B27發(fā)現(xiàn)7例可疑標(biāo)本，即所謂雙陽性標(biāo)本（HLA－B27和 HLA－B7均表現(xiàn)為陽性），他們的共同特點(diǎn)是熒光強(qiáng)度＞8，但HLA－B27細(xì)胞表達(dá)百分比數(shù)不足90%，見表2。流式細(xì)胞術(shù)通常的報(bào)告的結(jié)果為陰性，但實(shí)時(shí)熒光PCR法并不都一致，見圖3，A圖兩種檢測方法結(jié)果不一致，B圖兩種方法檢測結(jié)果均為陰性。

表2 可疑標(biāo)本檢測結(jié)果比較

圖3 可疑標(biāo)本

3 討論

Chou等［3］在家族性研究中發(fā)現(xiàn) HLA－B27是一個(gè)有用的預(yù)測指標(biāo)，因?yàn)镠LA－B27陰性個(gè)體中，發(fā)展為AS的可能性幾乎是零，而在HLA－B27陽性的個(gè)體中，發(fā)生AS的可能性是20%－30%。因此，HLA－B27對臨床診斷提供關(guān)鍵的支持依據(jù)。經(jīng)過采用流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時(shí)熒光PCR法同時(shí)檢測138例患者血中HLA－B27表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兩種檢測方法符合率為97.8%，其準(zhǔn)確性、可靠性和自動(dòng)化程度完全符合臨床檢測要求。但又各有其優(yōu)缺點(diǎn)。

流式細(xì)胞術(shù)檢測HLA－B27原理是采用熒光標(biāo)記的單克隆抗體與細(xì)胞表面的HLA－B27抗原相結(jié)合，然后用流式細(xì)胞儀檢測HLA－B27表達(dá)的細(xì)胞數(shù)和熒光強(qiáng)度，判斷結(jié)果。這種方法操作簡單，自動(dòng)化程度高，一份樣品40分鐘內(nèi)便可得出結(jié)果，而且重復(fù)率好。但流式細(xì)胞術(shù)也有不足之處。由于HLA－B27抗體除了能和HLA－B27抗原結(jié)合之外，與HLA－B7抗原也有一定的交叉反應(yīng)。正是因?yàn)镠LA－B7抗原和HLA－B27抗原競爭性的與HLAB27抗體結(jié)合，所以HLA－B27檢測中可能出現(xiàn)假陽性的可能。Macardle等［4］報(bào)道流式細(xì)胞術(shù)檢測HLA－B27誤差率為5%，其中部分原因就是HLAB7抗原陽性的患者，可能會給HLA－B27的判斷造成誤差。本研究采用HIA－B27／HLA－B7雙標(biāo)記熒光探針檢測HLA－B27，其優(yōu)點(diǎn)在于避免了假陽性結(jié)果的報(bào)告，但對于假陰性的誤判難以克服。

實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測 HLA－B27原理，是在PCR反應(yīng)液加入熒光染料，該染料能與雙鏈DNA特異性結(jié)合，通過實(shí)時(shí)檢測反應(yīng)體系熒光信號強(qiáng)度，達(dá)到檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的目的。實(shí)時(shí)熒光PCR法直接檢測 HLA－B27抗原的編碼基因，不必有與HLA－B7產(chǎn)生交叉反應(yīng)之虞，故能準(zhǔn)確地做出判斷。兩種方法的檢測結(jié)果有3例標(biāo)本不符，主要原因是本研究中流式細(xì)胞術(shù)檢測HLA－B27和HLA－B7兩種抗原，如果標(biāo)本HLA－B27平均熒光強(qiáng)度＞8而表達(dá)的細(xì)胞數(shù)＜90%，我們高度懷疑是HLA－B7抗原引起的干擾，進(jìn)而臨床上我們傾向于報(bào)告HLA－B27抗原陰性，但是這就會造成兩種抗原都是陽性標(biāo)本的漏檢。我們分析了類似的7例標(biāo)本，這些標(biāo)本的共同特點(diǎn)是平均熒光強(qiáng)度＞8，而B27表達(dá)的細(xì)胞數(shù)＜90%，其中3例標(biāo)本兩種方法檢測結(jié)果不符，4例標(biāo)本結(jié)果完全符合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明平均熒光強(qiáng)度＞8而B27表達(dá)的細(xì)胞數(shù)＜90%的情況下，流式細(xì)胞術(shù)已無能為力，提示需要采用微量細(xì)胞毒［5］或PCR方法進(jìn)行確認(rèn)，而實(shí)時(shí)熒光PCR法確實(shí)能彌補(bǔ)這一不足。擬采用流式細(xì)胞術(shù)檢測樣品，需當(dāng)天處理，而且不能凍存。而采用實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測的樣品的可以在－80℃長期保存。這樣就為我們提出一種可采納的方法：將流式細(xì)胞術(shù)檢測數(shù)的雙陽性標(biāo)本放入冰箱凍存，待積攢到一定數(shù)量之后，用實(shí)時(shí)熒光PCR法作進(jìn)一步確認(rèn)。如果本室的實(shí)驗(yàn)條件不允許，也可集中送到其他實(shí)驗(yàn)室檢測。為臨床提供可靠和準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。本研究中實(shí)時(shí)熒光PCR法與流式細(xì)胞術(shù)兩種方法檢測人類白細(xì)胞抗原HLA－B27的符合率高，雖然實(shí)時(shí)熒光PCR法的操作較流式細(xì)胞術(shù)繁瑣，但在解決雙陽性標(biāo)本時(shí)具有優(yōu)越性，使臨床的檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確和可靠。

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