VDR基因多態(tài)性與寧夏回漢族白癜風(fēng)患者的相關(guān)性研究

郭 睿，郝雁杰，汪京峽，劉 霞，楊文斌

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川750004；2.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院 皮膚科；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 皮膚科）

白癜風(fēng)是一種常見的色素脫失性疾病，其白斑可發(fā)生在身體任何部位，但因病因復(fù)雜，目前尚無滿意的治療方法，因白斑多發(fā)在暴露部位，患者生活質(zhì)量受到影響。近年來，國內(nèi)外許多文獻研究了維生素D受體（Vitamin D Recepter VDR）與自身免疫性疾病的關(guān)系，1，25－二羥膽骨化醇［1，25（OH）2D3］是維生素D的活性形式，介導(dǎo)VDR發(fā)揮與免疫性疾病 有 關(guān) 的 生 物 學(xué) 效 應(yīng)［1］。近 年 發(fā) 現(xiàn) 1，25（OH）2D3和類似物通過VDR影響黑素生成，調(diào)節(jié)機體的免疫功能［2］，從而與白癜風(fēng)的發(fā)病有一定的相關(guān)性，也有研究表明白癜風(fēng)患者存在VDR的低表達，而且發(fā)現(xiàn)維生素D衍生物對白癜風(fēng)具有治療作用［3］。本文運用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（PCR－RFLP）技術(shù)檢測寧夏地區(qū)回漢族白癜風(fēng)患者與正常對照組中VDR基因FokI、BsmI位點的頻率分布，以分析VDR與回漢族白癜風(fēng)患者發(fā)病的相關(guān)性，更重要的是為維生素D治療白癜風(fēng)患者提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象 來自本院2008年3月至2011年3月皮膚科門診參照文獻［4］確診的尋常型白癜風(fēng)患者251例，其中漢族136例，回族115例，男性130人，女性121人，年齡3歲－75歲。正常對照組來自本院體檢的健康人263例，漢族142例，回族121例，其中男性137人，女性126人，年齡在18歲－65歲，1，2，3級親屬中均無白癜風(fēng)患者。患者之間、對照組之間及患者與對照組之間均無血緣關(guān)系，對照組性別、年齡與患者組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。所有的研究對象簽署知情同意書，并完成流行病學(xué)調(diào)查表，靜脈采血3－5ml，EDTA抗凝，－20℃保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 取外周EDTA抗凝血200μl，采用Tangen公司DNA提取試劑盒提取基因組DNA，用紫外分光光度法 （A260／280比值）確定DNA純度，A260測定DNA濃度。

1.2.2 引物的設(shè)計與合成 參照文獻［5］設(shè)計引物，F(xiàn)okI： 5′ AGCTGRCCCTGGCACTGACTCTGGCTCT3′， 5′ GAGGGAGAAGAAGCAAGGTGTTTCCAT3′。 BsmI： 5′ GGGAGACGTAGCAAAAGG3′，5′CAGTGACCCTTGACCTCT3′。

1.2.3 PCR－RFLP檢測兩個SNPs的基因型

1.2.3.1 PCR反應(yīng)體系 ddH2O 5.15μl，2×PCR Mix6.25μl，Primer F（10μmol／L）0.25μl，Primer R （10μmol／L）0.25μl，Taq DNA polymerase（5 U／μl）0.1μl，DNA template（50ng／μl）0.5μl，總體積12.5μl。

1.2.3.2 PCR反應(yīng)條件設(shè)置 預(yù)變性95℃5min，變性95℃30s，退火60℃30s（FokI）、52℃30s（BsmI），延伸72℃30s，總延伸72℃10min，35個循環(huán)。PCR完成后，用2.5%瓊脂糖電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物。

1.2.3.3 限制性核酸內(nèi)切酶的選擇及酶切反應(yīng)條件：分別為FokI和BsmI限制性內(nèi)切酶下37℃孵育16小時。

1.2.3.4 FokI酶切反應(yīng)體系：FokI酶0.25μl，10×NEBbuffer 1μl，ddH2O3.75μl，DNA 模板5μl，總體積10μl；BsmI酶切反應(yīng)體系：BsmI酶0.25 μl，10×NEBbuffer 1μl，ddH2O 3.65μl，100×BSA0.1μl，DNA模板5μl，總體積10μl。酶切孵育完成后進行3%瓊脂糖凝膠電泳，并在Syngene凝膠成像儀下觀察并記錄結(jié)果，判斷基因型。

1.2.4 質(zhì)量控制

1.2.4.1 重復(fù)性試驗 為保證酶切結(jié)果的正確性，隨機抽取了30例樣本進行了2個SNPs位點的PCRRFLP重復(fù)實驗，結(jié)果與先前的分型結(jié)果均一致。

1.2.4.2 實驗結(jié)果的雙遍錄入 用Excel建立數(shù)據(jù)庫，對實驗結(jié)果雙遍錄入和校對。內(nèi)容包括樣本編號、年齡、姓名和2個SNPs的基因分型結(jié)果，然后進行數(shù)據(jù)合并，經(jīng)數(shù)據(jù)整理和校對無誤后應(yīng)用SPSS13.0軟件進行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

在SPSS13.0軟件中將實驗數(shù)據(jù)建立數(shù)據(jù)庫。基因型頻率等計數(shù)資料分析采用χ2檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義，用OR值和95%CI確定SNPs多態(tài)性分型與白癜風(fēng)的相關(guān)性。

Hardy－Weinberg平衡定律吻合度、各SNPs間連鎖不平衡（LD）分析和單體型分析均采用SHEsis在線軟件進行分析（http：／／analysis.bio－x.cn／my－Analysis.php）。

2 結(jié)果

2.1 遺傳平衡性檢驗（Hardy－Weinberg檢驗）

應(yīng)用SHEsis軟件對患者組和對照組FokI、BsmI兩個位點的基因型分布進行 Hardy－Weinberg平衡檢驗，均符合 H－W 平衡（P＞0.05），說明所選對照組具有群體代表性。

2.2 VDR基因FokI、BsmI位點多態(tài)性酶切結(jié)果

圖1為FokI（C→T）位點酶切電泳圖譜，1泳道為FF野生純合子，產(chǎn)生267bp一個片段，2、3、7、8、9泳道為Ff雜合子，產(chǎn)生267bp、206bp和61bp（由于61bp片段過小，在3%瓊脂糖凝膠電泳中不易分辨，但不影響基因型分析）三個片段，5、6、10泳道為ff突變純合子，產(chǎn)生206bp和61bp兩個片段，M 為100bp－600bp DNA Marker。圖2為BsmI（A→G）位點酶切電泳圖譜，1、2、3、4、6、7、8、9、10泳道為bb純合突變子，產(chǎn)生193bp和165bp兩個片段，5泳道為Bb雜合子，產(chǎn)生358bp、193bp和165bp三個片段，11泳道為BB純合子，產(chǎn)生358 bp一個片段，M為100bp－600bp DNA Marker。

圖1 FokI位點酶切電泳圖譜

圖2 BsmI位點酶切電泳圖譜

2.3 VDR基因FokI、BsmI位點基因型分布及與白癜風(fēng)易感性的關(guān)系。

2.3.1 FokI位點的基因型和等位基因的分布頻率在寧夏回漢族白癜風(fēng)患者和對照組中均無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3.2 BsmI位點的基因型和等位基因在寧夏回漢族白癜風(fēng)患者和對照組中的分布頻率見表1－3。

2.4 VDR基因單體型與白癜風(fēng)遺傳易感性的關(guān)聯(lián)分析

連鎖不平衡（Linkage disequilibrium，LD）分析采用SHEsis軟件分析VDR基因FokI和BsmI的連鎖不平衡系數(shù)（coefficient of linkage disequilibrium，D’），結(jié)果顯示各SNP位點兩兩之間均存在較強連鎖不平衡，各位點間均D’＞0.6。

表1 寧夏回族白癜風(fēng)患者組與對照組BsmI位點基因頻率的分布

表2 寧夏漢族白癜風(fēng)患者組與對照組BsmI位點基因頻率的分布

表3 寧夏地區(qū)白癜風(fēng)患者組與對照組Bsm I位點基因頻率的分布

3 討論

VDR基因位于12號染色體，且有高度多態(tài)性［6］，近年來對VDR的研究主要集中在第二外顯子FokI、第八外顯子BsmI、ApaI、第九外顯子TagI以及在3’端下游區(qū)域的poly－A多態(tài)性［7］。到目前為止，已在多個種族和民族中發(fā)現(xiàn)VDR基因呈多態(tài)性分布，在不同種族和民族中分布有差異［8］。非洲人VDR FokI位點f等位基因的頻率低于亞洲人和高加索人。亞洲人BsmI位點的B等位基因的頻率低于高加索人和非洲人［9］。中國漢族人口中BsmI位點呈多態(tài)性分布，突變型BB基因型頻率與韓國人的分布頻率相似，而遠(yuǎn)低于白種人的分布頻率［10］。

目前，國內(nèi)外許多學(xué)者研究了不同地區(qū)及不同民族的白癜風(fēng)患者與VDR基因多態(tài)性的相關(guān)性，而尚無寧夏地區(qū)回、漢族白癜風(fēng)與VDR基因多態(tài)性相關(guān)的研究，本課題分析了VDR基因Fok I和Bsm I兩個位點與寧夏地區(qū)回、漢族白癜風(fēng)患者發(fā)病的相關(guān)性，結(jié)果表明：Fok I位點基因型及等位基因的頻率在寧夏回、漢族病例組與對照組的分布均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），而試驗結(jié)果表明寧夏回族白癜風(fēng)患者攜帶BsmI位點的Bb基因型的頻率低于寧夏回族正常人群，分布有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），提示了攜帶Bsm I的Bb基因型的回族正常人群白癜風(fēng)的發(fā)病率可能減少，另外寧夏白癜風(fēng)患者攜帶BsmI位點的Bb基因型的頻率也低于正常對照人群，分布有顯著差異（P＜0.05），推測Bb基因型可能是寧夏地區(qū)尤其是回族人群中白癜風(fēng)發(fā)病的保護因素，在寧夏漢族白癜風(fēng)和對照組中BsmI位點的基因型及等位基因的頻率分布均無統(tǒng)計學(xué)意義。B等位基因在寧夏白癜風(fēng)患者組與對照組間分布差異具有顯著性意義（P＜0.05），提示B等位基因可能也是白癜風(fēng)發(fā)生的保護因子。楊勵［11］等研究了中國西北地區(qū)白癜風(fēng)患者及正常人群中VDR基因BsmI、FokI等位點基因型頻率和等位基因頻率的分布，結(jié)果顯示FokI位點基因型的頻率分布白癜風(fēng)患者與正常對照組無顯著性差異，這一點與我們的研究結(jié)果相同，但不同的是楊勵的結(jié)果中bb基因型在白癜風(fēng)患者中頻率較高，白癜風(fēng)患者與正常對照組有顯著性差異，可能與白癜風(fēng)的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。孫越，韓菁［12，13］等研究表明華中地區(qū) VDR BsmI位點Bb基因型在漢族尋常型白癜風(fēng)患者中頻率較高，攜帶Bb基因型可能會增加漢族人群患白癜風(fēng)的易感性，而本課題的結(jié)果卻是VDR BsmI位點Bb基因型是寧夏地區(qū)尤其是回族人群中白癜風(fēng)發(fā)病的保護因素，這進一步證實了不同民族及不同地區(qū)中VDR多態(tài)性的差異。Uitterlinden［14］在他的VDR的基因和生物學(xué)多態(tài)性一文中提出不同的種族群體中，等位基因頻率的差別很可能是進化進程和人群遺傳學(xué)行為的結(jié)果。白癜風(fēng)還是一種由多種易感基因的組合致病作用和未知的環(huán)境為誘因的復(fù)雜綜合征［15］，所以，生活環(huán)境的差異、飲食習(xí)慣的迥異、體內(nèi)維生素D水平的高低、日照時間的長短以及觀察樣本數(shù)大小等因素也是一些可能發(fā)生此種結(jié)果的合理解釋。白癜風(fēng)作為多基因遺傳疾病，由多個表型效應(yīng)很小的微效基因作用，其表現(xiàn)型是遺傳基因和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，需要結(jié)合周圍環(huán)境因素綜合分析。因此，對于VDR基因多態(tài)性與白癜風(fēng)的關(guān)系還需在其他不同地區(qū)、不同民族之間進行更大樣本的研究，并以家系為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)研究，以及與其他可能的易感基因進行連鎖分析。隨著研究的進一步加深，會為VDR的生化功能與白癜風(fēng)之間的關(guān)系提供基本參考信息。

［1］Jun Sun.Vitamin D and mucosal immune function［J］.Curr Opin Gastroenterol，2010，26（6）：591.

［2］Arnson Y，Amital H，Shoenfeld Y.Vitamin D and autoimmunity：new aetiological and therapeutic considerations［J］.Ann Rheum Dis，2007，66（9）：1137.

［3］Parsad D，Pandhi R，Dogra S，et al.Clinical study of repigmentation patterns with different treatment modalities and their correlation with speed and stability of repigmentation in 352vitiliginous patches［J］.J Am Acad Dermatol，2004，50（1）：63.

［4］中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會皮膚性病專業(yè)委員會色素病學(xué)組.白癜風(fēng)臨床分型及療效標(biāo)準(zhǔn)（2003年修訂稿）［J］.中華皮膚科雜志，2004，37（7）：440.

［5］Okita H，Ohtsuka T，Yamakage A，et al.Polymorphism of the vitam in D3receptor in patients with psoriasis［J］.Arch Dermatol Res，2002，294（4）：159.

［6］Pani MA，Knapp M，Donner H，et al.Vitamin D receptor allele combinations influence genetic susceptibility to type I diabetes in Germans［J］.Diabetes，2000，49：504.

［7］Ban Y，Taniyama M，Yanagawa T，et al.Vitamin D receptor initiation codon polymorphism influences genetic susceptibility to type 1diabetes mellitus in the Japanese population［J］.BMC Med Genet，2001，2：7.

［8］Zmuda JM，Cauley JA，F(xiàn)errell RE.Molecular epidemiology of vitamin D receptor gene variants［J］.Epidemiol Rev，2000，22（2）：203.

［9］Fleet JC，Harris SS，Wood RJ，et al.The BsmI vitamin D receptor restriction fragment length polymorphism（BB）predicts low bone density in premenopausal black and white women［J］.J Bone Miner Res，1995，10（6）：985.

［10］冷曙光，宋文佳，王雅文，等.538名中國漢族人口維生素D受體基因多態(tài)性分析［J］.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2002，36（5）：314.

［11］楊 勵，王 雷，孫林潮，等.維生素D受體基因多態(tài)性與白癜風(fēng)的相關(guān)性研究［J］.中國美容醫(yī)學(xué)，2007，16（3）：302.

［12］孫 越，韓 菁，吳瑞勤，等 .白癜風(fēng)患者維生素D受體ApaI基因多態(tài)性及免疫異常的研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志，2011，3：148.

［13］孫 越，韓 菁，吳瑞勤，等 .白癜風(fēng)患者維生素D受體BsmI基因多態(tài)性及免疫異常的研究［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2008，4：0392.

［14］Uitterlinden AG，F(xiàn)ang Y，Van Meurs JB，et al.Genetics and Biology of Vitam in D Receptor Polymorphisms［J］.Gene，2004，338（2）：143.

［15］Spritz RA.Recent progress in the genetics of generalized vitiligo［J］.J Genet Genomics，2011，38（7）：271.