體外定向誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

孫慶國(guó)，趙文靜，王日中，陳 鋒

（吉林省肝膽病醫(yī)院 檢驗(yàn)科，吉林 長(zhǎng)春130062）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSCs）是骨髓中一類具有多分化潛能的干細(xì)胞，在一定誘導(dǎo)條件下不僅可分化為中胚層的骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞，而且能分化成外胚層的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及內(nèi)胚層的肝細(xì)胞［1－4］。MSCs向心肌細(xì)胞的分化為擴(kuò)張性心肌病、心肌梗死等的治療帶來(lái)了新的希望［5］。研究證明，5－氮胞苷（5－aza）可誘導(dǎo)MSCs向心肌樣細(xì)胞分化，但如何促進(jìn)MSCs向心肌細(xì)胞分化仍是需要重點(diǎn)研究的問(wèn)題，為此本研究分離培養(yǎng)大鼠骨髓MSCs，并采用擴(kuò)張性心肌病大鼠血清和5－氮胞苷誘導(dǎo)培養(yǎng)骨髓MSCs，為MSCs向心肌細(xì)胞分化選擇最適微環(huán)境提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

DMEM培養(yǎng)基（Gibaco），胎牛血清（杭州四季青生物技術(shù)公司）；胰蛋白酶（Introvigen）、5－氮胞苷（Sigma）；淋巴細(xì)胞分離液（密度：1.077，上海試劑二廠，中國(guó)），SD大鼠（吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），兔抗大鼠肌鈣蛋白（cTnT）單抗（丹麥DAKO公司），SP免疫組化染色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)公司）。

1.2 大鼠骨髓MSCs的分離培養(yǎng)

選用8天SDE大乳鼠4只，斷頭處死，無(wú)菌分離股骨和脛骨，沖洗骨髓腔制成細(xì)胞懸液，淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心分離單個(gè)核細(xì)胞，接種2×106個(gè)單個(gè)核細(xì)胞于10cm培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2培養(yǎng)48h后換液，培養(yǎng)約10～14天細(xì)胞接近融合時(shí)按1∶4傳代，并標(biāo)記為Passage1（P1）；重復(fù)以上操作，傳代培養(yǎng)。

1.3 大鼠骨髓MSCs的表型鑒定

取3代MSCs細(xì)胞1×104個(gè)／孔接種于24孔培養(yǎng)板中（孔中預(yù)先放置無(wú)菌蓋玻片），37℃、5%CO2培養(yǎng)，待MSCs生長(zhǎng)接近80%融合時(shí)，取出蓋玻片，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定15min，蒸餾水沖洗，免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)MSCs細(xì)胞表面標(biāo)志CD44、CD29的表達(dá)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 擴(kuò)張性心肌病大鼠模型血清＋5－aza誘導(dǎo)培養(yǎng)大鼠MSCs

按照參考文獻(xiàn)［6］方法建立擴(kuò)張性心肌病大鼠模型，造模成功后無(wú)菌腹主動(dòng)脈采血，分離血清，－80℃冰箱保存?zhèn)溆?。取?代大鼠MSCs，以細(xì)胞濃度2×105／孔接種于6孔板內(nèi)（孔內(nèi)預(yù)置無(wú)菌蓋玻片），過(guò)夜培養(yǎng)后實(shí)驗(yàn)組采用5μmol／L 5－aza干預(yù)培養(yǎng)24h后棄去培養(yǎng)液，改用含20%擴(kuò)張性心肌病大鼠血清的低糖DMEM繼續(xù)培養(yǎng)；對(duì)照組始終采用常規(guī)培養(yǎng)基同等條件下培養(yǎng)，每3～4天換液一次，于加入擴(kuò)張性心肌病大鼠血清后1、2、3、4周取出蓋玻片，4%多聚甲醛固定，－20℃保存待檢。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)MSCs cTnT的表達(dá)

取出已固定細(xì)胞爬片，室溫放置30min，PBS沖洗后，免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)cTnT的表達(dá)（兔抗大鼠肌鈣蛋白單抗1∶200稀釋），結(jié)果判定：MSCs胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽(yáng)性。顯微鏡下每組觀察計(jì)數(shù)5個(gè)低倍視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨髓MSCs的分離培養(yǎng)和表型鑒定

淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心后獲得的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，部分細(xì)胞貼壁，并有少部分細(xì)胞已開(kāi)始分裂增殖（圖1A、B），隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞集落不斷增多，擴(kuò)大，培養(yǎng)約10～14天細(xì)胞達(dá)80%融合。傳代骨髓MSCs很快貼壁，呈梭形，增殖迅速，約6～7天即可傳代培養(yǎng)。

圖1 Morphological features of rat BMSCs（×40）

骨髓MSCs具有特征性的表面標(biāo)志，其特點(diǎn)是不表達(dá)造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志CD34和CD45，表達(dá)CD29、CD44、CD105和CD166等間充質(zhì)干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志［7］，免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示表明：本研究分離培養(yǎng)的骨髓MSCs高表達(dá)CD44和CD29（圖2），不表達(dá)CD34。

圖2 The expression of CD44and CD29in rat BMSCs（×100）

2.2 擴(kuò)張性心肌病大鼠模型血清＋5－aza誘導(dǎo)培養(yǎng)MSCs的形態(tài)學(xué)觀察和cTnT的免疫組化染色結(jié)果

對(duì)照組大鼠骨髓MSCs未發(fā)生形態(tài)改變，呈成纖維細(xì)胞樣整齊排列，培養(yǎng)第7天即長(zhǎng)滿瓶底；擴(kuò)張性心肌病大鼠模型血清＋5－aza誘導(dǎo)培養(yǎng)組大鼠骨髓MSCs生長(zhǎng)良好，7天后細(xì)胞形態(tài)即發(fā)生變化，體積變大，緊密平行排列生長(zhǎng)，而且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，梭形細(xì)胞的比例下降，細(xì)胞多呈桿狀，少數(shù)細(xì)胞呈不規(guī)則外形，相鄰細(xì)胞間的胞膜有接觸，逐漸相連呈肌管狀。

擴(kuò)張性心肌病大鼠模型血清＋5－aza誘導(dǎo)組MSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)7、14、21、28天cTnT均呈陽(yáng)性表達(dá)，其表達(dá)陽(yáng)性率分別為（18.4±3.2）%、（24.5±4.8）%、（50.8±6.7）%和（75.4±10.5）%，結(jié)果表明隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)陽(yáng)性率增高，不同時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；未經(jīng)5－aza誘導(dǎo)的B MSCs中未見(jiàn)cTnT表達(dá)（圖3）。

圖3 Morphological features and cTnT expressiojn of rat BMSCs in DCM rat serum group（×100）

3 討論

MSCs在骨髓中的含量極少，僅占骨髓細(xì)胞的0.001%－0.01%［8］，需要在體外進(jìn)行分離擴(kuò)增培養(yǎng)才能滿足細(xì)胞移植的需要。分離骨髓MSCs的分離方法主要有4種：密度梯度離心法貼、壁培養(yǎng)法、流式細(xì)胞儀分選法和免疫磁珠分選法。本研究采用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合分離培養(yǎng)大鼠骨髓MSCs，研究結(jié)果顯示，密度梯度離心獲得的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)48h后部分細(xì)胞貼壁，并呈集落式生長(zhǎng)，傳代細(xì)胞再形成集落式生長(zhǎng)，呈均勻有序的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞生長(zhǎng)，傳代周期為6－7天。主要從細(xì)胞的形態(tài)和培養(yǎng)特性、表面細(xì)胞標(biāo)志的表達(dá)以及分化潛能3個(gè)方面鑒定MSCs，本研究采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)大鼠骨髓MSCs的表型，結(jié)果表明分離培養(yǎng)的細(xì)胞高表達(dá)CD44和CD29，CD34表達(dá)陰性。結(jié)果顯示本研究獲得較純化，高活性的BMSCs，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

MSCs可以分化為心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，目前MSCs已經(jīng)成為治療心血管疾病的種子細(xì)胞［9］，成為心血管疾病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，5－aza是目前公認(rèn)的可以誘導(dǎo)MSCs向心肌細(xì)胞分化的藥物，但有文獻(xiàn)報(bào)道5－aza在誘導(dǎo)MSCs分化為心肌細(xì)胞的同時(shí)，其可以誘導(dǎo) MSCs的凋亡［10－12］。同時(shí)大量研究結(jié)果表明，體外模擬心肌微環(huán)境，可高效誘導(dǎo)MSCs分化為心肌細(xì)胞。cTnT是心肌肌鈣蛋白中具有較高特異性的亞型，是鑒定心肌源性細(xì)胞的特異性標(biāo)志物［13］，本研究在體外采用擴(kuò)張型心肌病大鼠模型血清＋5－aza對(duì)MSC進(jìn)行誘導(dǎo)，并采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法鑒定cTnT的表達(dá)，結(jié)果顯示擴(kuò)張型心肌病大鼠模型血清＋5－aza誘導(dǎo)培養(yǎng)組BMSCs生長(zhǎng)狀態(tài)良好，7天后細(xì)胞的形態(tài)即發(fā)生明顯變化，并隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈桿狀，排列具有方向性，逐漸相連呈肌管狀，免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示誘導(dǎo)組 MSCs的cTnT呈陽(yáng)性表達(dá)，而未經(jīng)5－aza誘導(dǎo)BMSCs中未見(jiàn)cTnT表達(dá)，本研究在體外找到更適宜誘導(dǎo)BMSCs向心肌細(xì)胞分化的條件，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)，相關(guān)研究正在深入進(jìn)行中。

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