jck多囊腎小鼠腎囊泡上皮細胞MAPK信號通路上調(diào)

闞秀芳，趙麗晶，李 浩，李丁洋，邵 晨，謝愛國，趙麗娟＊

（1.長春市第二醫(yī)院 內(nèi)科，吉林 長春130062；2.吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理生理學系；3.沈陽軍區(qū)空軍招收飛行學員體檢隊）

常染色體顯性遺傳多囊腎?。╝utosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD）是一種較常見的單基因遺傳性疾病，在人群中發(fā)病率高達1／1000－1／400，占我國終末期腎衰竭病因的第4位。ADPKD病變以雙腎多發(fā)性進行性囊泡為主要特征，繼發(fā)引起腎功能改變，終末期導(dǎo)致腎衰。ADPKD病程長，給病人和社會造成的經(jīng)濟負擔較大。目前，除應(yīng)用腎移植和透析治療終末期腎衰，尚無能夠阻止囊泡的發(fā)生和生長的有效藥物［1－2］。因此，針對ADPKD的發(fā)病機制，尋找預(yù)防或延緩ADPKD發(fā)病甚至逆轉(zhuǎn)其病程的新藥物是該領(lǐng)域的研究熱點。

我們的前期研究結(jié)果表明：8周齡jck小鼠腎臟顯著增大，出現(xiàn)多發(fā)、大小不一的腎囊泡。囊泡上皮細胞呈扁平狀，提示由于囊液過度分泌引起的囊內(nèi)壓增加所致。jck腎囊泡上皮細胞表達AQP2、AQP3和AQP4，提示其腎囊泡上皮細胞來源于腎集合管，并具有腎集合管的功能特性［3］。

目前認為多囊腎病腎囊泡的發(fā)生和進展主要是三個病理過程共同作用的結(jié)果：腎小管上皮細胞過度增殖、囊泡內(nèi)液體的積聚和細胞外基質(zhì)的重構(gòu)［4，5］。激活腺苷酸環(huán)化酶（AC）可以使細胞內(nèi)cAMP增加，激活PKA，在生長因子和細胞內(nèi)低鈣的共同作用下，通過激活 Raf－1／B－Raf－MEK－ERK通路，促進細胞增殖。但MAPK在jck多囊腎動物模型多囊腎囊泡發(fā)生發(fā)展中的作用尚未見報道。

本研究擬應(yīng)用jck PKD小鼠模型，評價信號通路蛋白在jck小鼠腎囊泡上皮細胞的調(diào)控，確定jck PKD腎囊泡上皮細胞異常增殖過程中，細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路所起的作用，為研究腎囊泡生成和增大機制，探討抑制PKD囊泡增大的藥物作用靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料 H－Ras、p－Raf、p－MEK、pERK、ERK、c－fos和β－actin多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG購自美國Sigma公司，ECL Plus試劑盒購自Amersham公司。

1.2 動物模型 雜合子jck PKD小鼠模型購于Jackson Lab，潔凈級條件飼養(yǎng)，經(jīng)雜合子相互交配獲得純合子小鼠。12周齡時稱體重，取雄性小鼠血進行血尿素測定，分離腎臟進行腎臟指數(shù)、腎臟組織學、蛋白表達調(diào)控分析。同窩雄性野生型小鼠作對照。

1.3 組織學觀察 將腎臟組織標本用10%甲醛固定后，石蠟包埋、切片，然后進行蘇木精伊紅（HE）染色。光學顯微鏡下觀察、照相。

1.4 Western blot 腎組織超聲勻漿30s，用Biorad蛋白定量試劑盒對樣品進行蛋白定量。配制12%SDS－PAGE凝膠，取20μg蛋白質(zhì)樣品，加入等體積2×上樣緩沖液，100V恒壓電泳，采用Bio－Rad轉(zhuǎn)膜儀將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至PVDF蛋白轉(zhuǎn)移膜上，再將PVDF膜置于5% 脫脂奶粉中室溫封閉60 min。TBS－T漂洗2次，加入1∶500倍稀釋的抗H－Ras、p－Raf、p－MEK、pERK、ERK、c－fos、和 β－actin多克隆抗體，4℃下反應(yīng)過夜，TBS－T洗膜10 min×3次，加入1∶10 000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，室溫孵育30min，TBS－T洗膜。ECL Plus試劑盒顯影。

2 結(jié)果

2.1 jck PKD小鼠表型 12周齡jck純合子小鼠體重明顯低于同窩野生型小鼠（圖1A），可見腹部明顯增大，活動受限。jck純合子小鼠的腎臟指數(shù)大于野生型小鼠腎臟4倍以上（P＜0.01，圖1B）。血尿素水平在jck純合子小鼠超過60mM，為野生型的7倍以上（P＜0.01，圖1C），提示已出現(xiàn)嚴重的腎功能損傷。

2.2 jck PKD小鼠腎臟組織形態(tài) 12周齡jck純合子小鼠腎臟組織表現(xiàn)多發(fā)、大小不一囊泡，囊泡上皮細胞呈扁平狀，腎囊泡占腎組織的90%以上（圖2A）。而同窩野生型小鼠腎臟則呈現(xiàn)正常腎組織結(jié)構(gòu)（圖2B）。

2.3 MAPK信號通路蛋白在腎臟的表達調(diào)控Western Blot分析結(jié)果表明，jck腎臟表達的 HRas、p－Raf、p－MEK、pERK 和c－fos蛋白水平與野生型腎臟相比明顯上調(diào)，表明囊泡上皮細胞表達的Raf、MEK、ERK在jck腎臟的磷酸化明顯高于其在野生型腎臟的表達水平，其可能是MAPK通路激活所致。見圖3。

圖1 jck小鼠表型

圖2 jck純合子小鼠腎臟異常

圖3 MAPK信號通路在多囊腎組織調(diào)控分析

3 討論

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個基因自發(fā)突變可引起小鼠PKD。這些PKD小鼠模型多為常染色體隱性遺傳，但其病理學特征類似人常染色體顯性遺傳PKD［6］，常被用作PKD模型研究PKD的發(fā)病機制和研發(fā)治療PKD候選藥物。小鼠常染色體隱性遺傳病（juvenile cystic kidney，jck）是一常用PKD小鼠模型［7，8］。jck純合子小鼠3天齡時出現(xiàn)腎囊泡，4－5周齡時發(fā)展成明顯多囊腎病，發(fā)病小鼠可存活4個多月。

大量的動物體內(nèi)外實驗和來源于人ADPKD腎臟標本的研究結(jié)果均表明：cAMP介導(dǎo)的信號通路是調(diào)節(jié)腎小管上皮細胞表型變化（過度增殖）和囊液積聚的最主要信號通路。目前研究已發(fā)現(xiàn)Ras－BRaf－MEK－ERK信號通路在ADPKD的發(fā)病過程中起著重要的作用。在ADPKD上皮細胞中，高水平的細 胞 內(nèi) cAMP 通 過 促 進 Ras－B－Raf－MEK－ERK信號通路促進囊泡上皮細胞的增殖和生長。在ADPKD上皮細胞中，囊泡上皮細胞內(nèi)Ca2＋水平降低，PI3K－AKT途徑對B－Raf的抑制作用減弱，導(dǎo)致EGF等生長因子主要通過 Ras－B－Raf－MEK－ERK信號通路，上調(diào)周期蛋白 Egr－l，c－myc，c－fos等細胞增殖相關(guān)基因的表達水平，促進囊泡上皮細胞的異常增殖［9］。我們的實驗結(jié)果表明jck小鼠腎臟囊泡上皮細胞 MAPK通路中的 H－Ras、p－Raf、p－MEK、pERK和c－fos蛋白水平與野生型腎臟相比明顯上調(diào)，表明Raf、MEK、ERK在jck腎臟囊泡上皮細胞顯著磷酸化。這些結(jié)果證實jck腎囊泡上皮細胞MAPK信號通路激活，提示其在多囊腎病發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，MAPK信號通路有可能成為治療多囊腎病的候選藥物篩選的藥物靶點。

［1］張樹忠，胡以平，梅長林，等.Ⅱ型多囊腎致病基因PKD2突變的研究進展［J］.中華腎臟病雜志，2006，7：440.

［2］高晉生，楊寶學.常染色體顯性遺傳多囊腎病的治療研究進展［J］.中國藥理學通報，2009，25：141.

［3］闞秀芳，周 虹，楊寶學.水通道蛋白在多囊腎病小鼠腎囊泡上皮細胞的表達與調(diào)控［J］.中華腎臟病雜志，2010，26：39.

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［5］Yamaguchi T，Nagao S，Kasahara M，et al.Renal accumulation and excretion of cyclic adenosine monophosphate in a murine model of slowly progressive polycystic kidney disease［J］.Am J Kidney Dis，1997，20：703.

［6］Guay－Woodford LM.Murine models of polycystic kidney disease：molecular and therapeutic insights［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2003，285：F1034.

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