人巨細(xì)胞病毒pp150－pp65蛋白的表達(dá)與應(yīng)用

金玉芬，李艷蕾，華 艷，張曉剛，于 庭＊

（1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長春130041；2.北京英諾特生物技術(shù)有限公司，北京100070）

人巨細(xì)胞病毒（Human Cytomegalovirus，簡稱HCMV）屬皰疹病毒β亞科，是一種DNA病毒，其感染在人群中廣泛存在，我國人群中HCMV感染相當(dāng)嚴(yán)重。HCMV是世界范圍內(nèi)引發(fā)先天性感染最常見的一種病毒，在活產(chǎn)兒中感染率為0.2%－2.0%，是風(fēng)疹病毒感染的2倍［1］。婦女在妊娠初期受HCMV原發(fā)感染是引起胎兒宮內(nèi)感染和發(fā)育缺損的重要原因，在孕期原發(fā)性感染HCMV的胎兒和新生兒中，80%可導(dǎo)致智力低下、畸形和死亡［2］。HCMV也是器官移植失敗和艾滋病病人并發(fā)感染死亡的主要原因之一［3］。對非免疫缺陷者常導(dǎo)致長期隱性感染，甚至引起感染細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、畸變或癌變等［4］。因此快速準(zhǔn)確的診斷HCMV病毒感染具有十分重要的意義。

HCMV的結(jié)構(gòu)蛋白包括衣殼蛋白、被膜蛋白以及包膜蛋白。HCMV pp65是HCMV被膜蛋白中最主要的一種，主要是參與病毒基因調(diào)節(jié)以及改變宿主細(xì)胞的代謝，而且在不同的HCMV病毒株中，pp65具有高度的保守性［5］，含有IgM結(jié)合表位，對判斷急性感染具有很重要的意義。Rolf［6］等的實(shí)驗(yàn)表明pp150的495－691aa片段是確診HCMV既往感染的最適抗原（IgG結(jié)合表位），在檢測HCMV原發(fā)及急性期感染中起著極其重要的作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

人巨細(xì)胞病毒培養(yǎng)物為中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所惠贈；細(xì)菌菌株及載體：pET28a質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存，E.coli BL21購自北京新經(jīng)科科技有限公司。酶及其他試劑：DNA polymerase，T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ均為TaKaRa公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、Ni－蛋白純化柱購自北京新經(jīng)科科技有限公司；試劑盒：抗巨細(xì)胞病毒抗體IgG檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）和抗巨細(xì)胞病毒抗體IgM檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）為意大利SORIN公司產(chǎn)品。

2 試驗(yàn)方法

2.1 聚合酶鏈反應(yīng)引物

根據(jù)目的片段的DNA序列，設(shè)計(jì)兩對引物（P1，P2）和（P3，P4）。P1和P2用于擴(kuò)增pp150基因片段，P3和P4用于擴(kuò)增pp65基因片段；引物P1和P4分別帶有NdeⅠ和XhoⅠ的酶切位點(diǎn)，引物P2和P3順序互補(bǔ)，并共同對應(yīng)于pp150上述片段的3’末端和pp65上述片段的5’末端序列。引物合成由上海生物工程有限公司完成。引物序列如下：

P1：ATCGCATATGGGCGGCGGTTCGGCCTTCTCG；P2：CGCAGCCACTACCCTTCCCGGGCTGGCC；P3：AAGGGTAGTGGCTGCGCTCTTCTTTTTCGATATCG；P4：ATCGCTCGAGGGGCTGCCATACGCCTTCCAATTCGGC。

2.2 目的基因的克隆

取病毒培養(yǎng)液1μl，加入10×Pfu高保真酶緩沖液5μl，濃度2mmol／L dNTPs 5μl，P1、P2引物各2μl，Pfu高保真酶0.5μl，加滅菌雙蒸水至50 μl。充分混勻。反應(yīng)條件為變性94℃30s，退火65℃30s，復(fù)性72℃60s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，再72℃延伸10min。P3、P4引物克隆方法同上。

再以第一輪PCR擴(kuò)增得到的pp150片段和pp65片段為模板，加入引物P1和P4，擴(kuò)增pp150－pp65片段；得到串聯(lián)的目的基因重組片段pp150－pp65。反應(yīng)條件為pp150片段和pp65片段分別為1μl，加入10×Pfu高保真酶緩沖液5μl，濃度2 mmol／L dNTPs 5μl，P1、P4引物各2μl，Pfu高保真酶0.5μl，加滅菌雙蒸水至50μl。充分混勻。反應(yīng)條件為變性94℃30s，退火65℃30s，復(fù)性72℃90s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，再72℃延伸10min。

2.3 pET28a－pp150－pp65重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

純化的PCR產(chǎn)物pp150－pp65經(jīng)NdeI和XhoI酶切，并與經(jīng)過同樣處理的pET28a原核表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10中，抽取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行酶切鑒定。并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中。

2.4 pET28a－pp150－pp65融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將含pET28a－pp150－pp65重組質(zhì)粒的 BL21菌液以1∶100的比例加入到LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)2小時(shí)后加入IPTG至終濃度為1mmol／L，37℃誘導(dǎo)3小時(shí)后離心收集菌體，重懸于2×樣品緩沖液中，100℃煮沸，進(jìn)行SDS－PAGE電泳分析。

2.5 表達(dá)蛋白的純化

取誘導(dǎo)后的菌體培養(yǎng)液離心收集菌體，經(jīng)超聲破碎后利用Ni－蛋白純化柱進(jìn)行純化。具體操作按照說明書進(jìn)行。分別收集洗脫峰蛋白，并進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳分析。

2.6 重組蛋白的抗原性分析

將重組的菌體蛋白經(jīng)SDS－PAGE凝膠電泳后，切膠進(jìn)行蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移，將目的蛋白電轉(zhuǎn)至NC膜上，用含質(zhì)量濃度50g／L脫脂奶的PBS封閉NC膜，4℃過夜，PBS洗膜3次。以封閉液1∶20稀釋陽性血清，與NC膜于37℃共同孵育2h后，用PBS洗膜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG，37℃孵育1h，PBS洗膜后TMB顯色，至目的條帶顯色清晰時(shí)終止反應(yīng)。

2.7 巨細(xì)胞IgG／IgM抗體聯(lián)合檢測試劑盒（膠體金法）的建立

按經(jīng)典的氯化金－檸檬酸三鈉還原法制備膠體金液。用鼠抗人IgM（μ鏈）單克隆抗體、重組巨細(xì)胞病毒抗原和兔抗巨細(xì)胞病毒抗體最佳包被濃度包被硝酸纖維素膜，并用方正滴定法確定最佳包被濃度，膠體金標(biāo)記重組巨細(xì)胞病毒（CMV）抗原為示蹤物，加入待檢血清，觀察檢測線和質(zhì)控線位置顏色的變化。

3 結(jié)果

3.1 目的基因的克隆和鑒定

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在1 167bp左右可見特異性擴(kuò)增條帶。將PCR擴(kuò)增得到的pp150－pp65目的基因純化后，與相同酶切的質(zhì)粒pET28a連接，最終連接到表達(dá)菌體BL21中。表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定，得到1 178bp長度的目的基因片段。與預(yù)期大小一致（圖1）。

序列測定結(jié)果表明插入序列與目的片段完全一致。

3.2 蛋白純化

將空載體質(zhì)粒pET28a和重組質(zhì)粒pET28app150－pp65的菌液進(jìn)行IPTG 誘導(dǎo)后，經(jīng)SDSPAGE電泳檢測，看到空載體質(zhì)粒pET28a沒有表達(dá)蛋白；而含重組質(zhì)粒 pET28a－pp150－pp65菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在分子量45kd處出現(xiàn)一條新的蛋白帶，其大小與推測的ppET28a－pp150－pp65融合蛋白分子量一致，表達(dá)量約占菌體總蛋白的40%左右（見圖2）。

3.3 Western blot鑒定

將純化的目的蛋白進(jìn)行 Western blot免疫印跡，證實(shí)在45kd處有一特異性條帶（見圖3）。說明表達(dá)的pET28a－pp150－pp65蛋白有較好的免疫學(xué)活性。

圖1 CMV PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（從左至右分別為：蛋白 Marker，pp150－pp65）

圖2 pET28a－pp150－pp65表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE分析

圖3 純化產(chǎn)物的Western blot分析

3.4 巨細(xì)胞IgG／IgM抗體聯(lián)合檢測試劑盒（膠體金法）的建立

3.4.1 最佳反應(yīng)條件的確定 用鼠抗人IgM（μ鏈）單克隆抗體、重組巨細(xì)胞病毒抗原和兔抗巨細(xì)胞病毒抗體包被硝酸纖維素膜，包被濃度分別為：2 mg／ml、2mg／ml和5mg／ml，包被量為1.0μl／cm；膠體金標(biāo)記重組巨細(xì)胞病毒（CMV）抗原為示蹤物，膠體金標(biāo)記物噴點(diǎn)量為25μl／cm，最佳反應(yīng)時(shí)間為20分鐘。

3.4.2 與進(jìn)口試劑盒的判定比較 用意大利SORIN的抗巨細(xì)胞病毒抗體IgG檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）和抗巨細(xì)胞病毒抗體IgM檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）與本研究研制的巨細(xì)胞病毒抗體（IgM／IgG）聯(lián)合檢測試劑盒（膠體金法）對本醫(yī)院的600份血清分別進(jìn)行對比。結(jié)果如下表1、表2所示。

表1 與意大利SORIN的抗巨細(xì)胞病毒抗體IgG檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）進(jìn)行對比

表2 與意大利SORIN的抗巨細(xì)胞病毒抗體IgM檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）進(jìn)行對比

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，本研究研制的巨細(xì)胞IgG／IgM抗體聯(lián)合檢測試劑盒（膠體金法）與意大利SORIN的CMV IgG抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）的陽性符合率和陰性符合率分別為92.7%和83.1%，總的符合率為90.2%。與意大利SORIN的CMV IgM抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）的陽性符合率和陰性符合率分別為88.1%和89.2%，總的符合率為88.5%。

4 討論

目前巨細(xì)胞病毒感染診斷方法有脫落細(xì)胞及組織病理檢查、病毒分離、分子雜交試驗(yàn)和血清學(xué)檢查等［7］，但由于前三種方法技術(shù)設(shè)備要求高，檢測周期長的局限性，無法廣泛使用，而血清學(xué)檢查具有簡便快速的特性使其在臨床上得到廣泛應(yīng)用。目前大多數(shù)檢測試劑采用的HCMV蛋白質(zhì)抗原主要是來源于病毒培養(yǎng)物或是重組表達(dá)的單一蛋白片段，由于蛋白質(zhì)抗原純度低及特異性差，造成假陽性而降低檢測特異性；或者由于單一片段抗原蛋白所含抗原決定簇較少，所識別的抗體相應(yīng)較少，易造成假陰性而降低檢測敏感性。雖然多種單一片段組合制備檢測試劑也可以避免上述問題，但必然要求多次進(jìn)行提取純化過程，而且小分子蛋白質(zhì)或多肽的提純技術(shù)要求更高，工作效率太低。

目前國內(nèi)檢測 HCMV－IgM 和 HCMV－IgG主要采用ELISA法，但該法檢測所需時(shí)間長，操作步驟繁瑣、易受類風(fēng)濕因子等因素的影響，所以結(jié)果不穩(wěn)定。而膠體金法與酶聯(lián)免疫分析法比較具有便捷、快速、操作簡單等多方面的優(yōu)點(diǎn)。但是目前市場上僅有的一些膠體金法試劑盒都是單獨(dú)檢測HCMV－IgM或HCMV－IgG抗體，尚無同時(shí)檢測 HCMV－IgM和IgG的產(chǎn)品。

本研究選擇pp150的483－682aa，pp65的357－545aa，通過PCR方法連接并制備重組蛋白pp150－pp65，通過 Western blot鑒定該融合表達(dá)具有較好的免疫學(xué)活性。根據(jù)間接法和捕獲法原理制備巨細(xì)胞病毒IgG／IgM聯(lián)合抗體檢測試劑盒（膠體金法），并分別與意大利SORIN公司的CMV抗體IgG檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）和CMV抗體IgM檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）進(jìn)行比較，符合率分別為90.2%和88.5%。研究結(jié)果表明pp150－pp65重組蛋白具有高特異性、強(qiáng)免疫原性，而根據(jù)該融合蛋白制備的巨細(xì)胞病毒IgG／IgM聯(lián)合抗體檢測試劑盒（膠體金法）不僅操作簡單，而且針對原發(fā)感染或者急性感染不同時(shí)期的血清都能檢測，不再受感染時(shí)間的限制，具有很好的應(yīng)用價(jià)值，完全能滿足市場的需要。

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