大鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白的實(shí)驗(yàn)研究

王淑榮，王晨光，齊首楠，蘇冠方

（吉林大學(xué)第二醫(yī)院 眼科，吉林 長春130041）

體外實(shí)驗(yàn)研究證明哺乳動物的視網(wǎng)膜干細(xì)胞（retinal stem cells，RSCs）具有自我更新的能力，并可被誘導(dǎo)分化成為多種類型的視網(wǎng)膜細(xì)胞，為治療眼科領(lǐng)域內(nèi)的致盲性眼底疾病帶來了希望，在本實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用含有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的質(zhì)粒對RSC進(jìn)行轉(zhuǎn)染，觀察細(xì)胞表達(dá)后的生長情況及分化情況，為將來進(jìn)一步應(yīng)用基因修飾的RSC進(jìn)行基因治療及細(xì)胞治療的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 出生10d的Wistar大乳鼠（體重約45 g），由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。胎牛血清、DMEM／F12培養(yǎng)基、B27添加劑（Gibco），胰蛋白酶、G418、EDTA（Sigma），pGCsilencerTM U6／Neo／GFP（上海吉凱公司），BrdU、多聚賴氨酸，nestin、NSE、GFAP兔抗大鼠多克隆抗體，小鼠抗大鼠BrdU單克隆抗體，SABC、DAB試劑盒（武漢博士德公司），倒置相差顯微鏡（Olympus），CO2培養(yǎng)箱（SANYO）等。

1.2 方法

1.2.1 RSCs的分離、培養(yǎng) 斷頸處死Wistar大乳鼠（出生10d的），應(yīng)用750ml／L乙醇消毒5min，取出眼球，在角膜緣后約3mm處環(huán)形剪開，分離取出睫狀體區(qū)組織，剪碎后應(yīng)用含有0.5ml含有2.5 g／L胰蛋白酶及0.2g／L EDTA的消化液于37℃下消化15min，期間震蕩3次。應(yīng)用含有100ml／L胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)液終止消化，離心棄上清后應(yīng)用無血清培養(yǎng)液洗滌最終制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為109／L，于37℃、50ml／L CO2、飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并添加20μg／L大鼠堿性成纖維生長因子（bFGF），20μg／L大鼠表皮生長因子（EGF）及1×B27添加劑。大約3d時半量換液，當(dāng)細(xì)胞團(tuán)較大時予以傳代，傳代應(yīng)用含有2.5g／L胰蛋白酶及0.2g／L EDTA的混合消化液消化細(xì)胞。

1.2.2 RSCs的鑒定 應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法進(jìn)行鑒定。細(xì)胞爬片預(yù)先經(jīng)多聚賴氨酸處理，檢測BrdU時需在固定細(xì)胞前1d向培養(yǎng)液中加入BrdU，調(diào)整其濃度為10μmol／L，爬片取出后PBS沖洗、40 g／L多聚甲醛室溫固定20min，PBS沖洗3次，每次5 min，2g／L triton X－100作用10min，0.1mol／L PBS洗3次，每次5min，300ml／L過氧化氫及純甲醇混合液（1∶50）室溫阻斷30min，蒸餾水洗2次，每次5 min。檢測BrdU的細(xì)胞爬片需用2NHCl 37℃孵育10min，BSA室溫封閉20min，傾去血清后加入nestin及BrdU一抗 （1∶200）4℃孵育過夜。用PBS代替一抗做空白對照，余步驟按照SABC試劑盒說明書操作，DAB發(fā)色后蘇木精復(fù)染、乙醇脫水、二甲苯透明、封片液封片后顯微鏡下觀察。

1.2.3 RSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染及篩選 實(shí)驗(yàn)分為轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染帶有綠色熒光蛋白的質(zhì)粒），轉(zhuǎn)染試劑對照組（Lipofectamine 2000）。轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞團(tuán)制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度約4×105細(xì)胞／孔。應(yīng)用24孔板參照轉(zhuǎn)染試劑說明書的技術(shù)參數(shù)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。每2－3d更換一次含有G418的篩選培養(yǎng)基。最佳篩選濃度為在篩選7d內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的最小G418濃度。

1.2.4 GFP轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分化及神經(jīng)標(biāo)志物鑒定轉(zhuǎn)染并篩選后的RSCs應(yīng)用含50ml／L胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)分化，觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分化情況，分化第7日應(yīng)用前述的免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測NSE及GFAP的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 RSCs的體外培養(yǎng)、鑒定

原代培養(yǎng)2d后可以觀察到呈懸浮生長的小球狀細(xì)胞團(tuán)，折光性強(qiáng)（圖1）。細(xì)胞團(tuán)數(shù)量在4－5d后逐漸增多，體積逐漸增大，至7－9d左右進(jìn)行細(xì)胞傳代。傳代后48h即可形成新的與原代相似的細(xì)胞團(tuán)，隨傳代次數(shù)增加細(xì)胞生長逐漸變緩。第2代RSCs細(xì)胞內(nèi)可檢測到nestin、BrdU均呈現(xiàn)陽性的棕黃色染色，空白對照組未見染色（圖2、3）。

圖1 原代視網(wǎng)膜干細(xì)胞（×200）

圖2 第2代視網(wǎng)膜干細(xì)胞nestin免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性（×200）

圖3 第2代視網(wǎng)膜干細(xì)胞BrdU免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性（×200）

圖4 轉(zhuǎn)染GFP的視網(wǎng)膜干細(xì)胞（×200）

2.2 RSCs轉(zhuǎn)染與篩選

經(jīng)過優(yōu)化確定應(yīng)用 DNA（μg）：轉(zhuǎn)染試劑（μl）1∶2.5比例進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，并確定應(yīng)用150μg／ml為最佳G418篩選濃度對轉(zhuǎn)染后第2日的細(xì)胞進(jìn)行篩選。轉(zhuǎn)染后大部分細(xì)胞形態(tài)比較接近于原始情況，未發(fā)生明顯變化，少部分細(xì)胞變?yōu)橘N壁生長，還有少部分細(xì)胞逐漸死亡（圖4），各實(shí)驗(yàn)組改變相似。更換篩選培養(yǎng)基后不帶有綠色熒光的干細(xì)胞逐漸死亡，帶有綠色熒光的細(xì)胞改變無明顯，細(xì)胞重新積聚成團(tuán)狀生長，一周后存活的細(xì)胞基本均為帶有綠色熒光的細(xì)胞，不表達(dá)綠色熒光的RSCs基本已全部死亡（圖5）。

2.3 轉(zhuǎn)染后的RSCs的體外誘導(dǎo)分化

應(yīng)用前述方法對轉(zhuǎn)染并已篩選后的RSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)后大部分細(xì)胞變?yōu)橘N壁生長，第3d時可見部分細(xì)胞出現(xiàn)小突起，隨著誘導(dǎo)分化時間的延長小突起不斷延伸，部分交織成網(wǎng)狀，分化7－10 d時可觀察到較多細(xì)胞具有神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)。GFP轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染試劑對照組細(xì)胞分化情況相似，無明顯差別。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法分別檢測到兩組細(xì)胞分化后均不同程度表達(dá)NSE及GFAP（圖6－8）。

圖5 轉(zhuǎn)染并篩選一周后的RSCs均表達(dá)GFP（×200）

圖6 轉(zhuǎn)染并篩選后的RSCs可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞（×400）

圖7 轉(zhuǎn)染并篩選的RSC誘導(dǎo)分化后細(xì)胞NSE免疫化學(xué)染色陽性（×400）

圖8 轉(zhuǎn)染并篩選的RSC誘導(dǎo)分化后細(xì)胞GFAP免疫化學(xué)染色陽性（×400）

3 討論

近年來一些研究認(rèn)為，存在于哺乳動物胚胎視網(wǎng)膜內(nèi)及成年哺乳動物的睫狀區(qū)［1－4］的干細(xì)胞或前體細(xì)胞具有一定的增殖能力，并可在體內(nèi)外誘導(dǎo)條件下分化為多種視網(wǎng)膜細(xì)胞［5－6］，并且某些特定基因的修飾將改變RSCs的分化特性，Jomary C［7］等將外源性轉(zhuǎn)錄因子Crx基因?qū)氲叫∈蠹叭祟惤逘顓^(qū)來源的RSCs，發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)RSCs分化出光敏感性光感受器細(xì)胞類型。Inoue等［8］將OTX2及CRX基因共同修飾的RSCs移植到小鼠眼內(nèi)時，發(fā)現(xiàn)基因修飾的干細(xì)胞的視網(wǎng)膜整合能力和分化能力得到增強(qiáng)。因此，RSCs定向分化機(jī)理的探索將為致盲性眼病的細(xì)胞治療與基因治療方法研究奠定理論基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)通過體外分離、培養(yǎng)，在體外成功擴(kuò)增出RSCs，具體表現(xiàn)為可自我更新的懸浮生長的細(xì)胞團(tuán)，并且免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示體外擴(kuò)增的細(xì)胞均表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物nestin，BrdU染色陽性提示細(xì)胞具有一定的體外增殖的能力。在完成RSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定后，本實(shí)驗(yàn)選取生長狀態(tài)較佳的第2代RSCs，經(jīng)過優(yōu)化DNA量與脂質(zhì)體的比例后成功將帶有GFP的質(zhì)粒導(dǎo)入到RSCs內(nèi)，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)的綠色熒光提示轉(zhuǎn)染成功并表達(dá)外源性蛋白質(zhì)，雖然通過轉(zhuǎn)染優(yōu)化后轉(zhuǎn)染率約在20%左右，但經(jīng)過轉(zhuǎn)染后的G418篩選，可有效的將未轉(zhuǎn)染外源性DNA的細(xì)胞清除，待轉(zhuǎn)染1w時，基本細(xì)胞均表達(dá)綠色熒光，提示經(jīng)過G418篩選后可使RSCs得到有效的富集及純化。

轉(zhuǎn)染GFP后細(xì)胞的形態(tài)及生長特性無明顯改變，并且和對照組一致，在存在血清等誘導(dǎo)條件下，帶有綠色熒光的RSCs也可分化為具有神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞，并表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物NSE及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP，提示本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染含有GFP的外源性DNA后沒有對細(xì)胞的生長、增殖及分化等特性發(fā)生明顯影響。本實(shí)驗(yàn)證明應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法可成功將外源性基因?qū)氲絉SCs內(nèi)并表達(dá)外源性蛋白質(zhì)，為下一步將一些具有治療功能的基因或?qū)Ω杉?xì)胞定向分化具有重要意義的特定基因?qū)氲郊?xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究奠定了理論基礎(chǔ)，并希望通過特定基因修飾改變干細(xì)胞的某些特性，為將闡明干細(xì)胞定向分化機(jī)理及應(yīng)用特定基因修飾的干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞治療及基因治療提供了理論依據(jù)。

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