ZHX2基因在肝細(xì)胞癌中表達(dá)水平及其臨床意義

徐洪彪，曹 宏，陳學(xué)博，趙紅蕾，孫月芳，田曉豐＊

（1.松原市乾安縣醫(yī)院 普外科，吉林 松原131400；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 普外科中心；3.吉林大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院）

人 類 同 源 框 （zinc－fingers and homeoboxes，ZHX）蛋白家族，包括ZHX1、ZHX2和ZHX3，分子結(jié)構(gòu)中均包括2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)（zinc－finger motifs）和5個(gè)同源結(jié)構(gòu)域（homeodomains，HDs）。3種蛋白自身可組成同源二聚體，2種蛋白相互之間也可形成異源二聚體。ZHX蛋白家族在組織中廣泛存在，作為轉(zhuǎn)錄抑制因子發(fā)揮重要的病理生理功能。ZHX2是ZHX蛋白家族成員之一，是2003年新克隆的轉(zhuǎn)錄抑制因子，位于染色體8q24.13，含有2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)和5個(gè)同源結(jié)構(gòu)域，其編碼的蛋白含837個(gè)氨基酸殘基，定位于細(xì)胞核內(nèi)［1］。近年來的研究結(jié)果顯示，ZHX2參與正常肝細(xì)胞中肝癌標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄抑制，提示ZHX2的表達(dá)缺失可能是肝細(xì)胞癌（HCC）發(fā)生的關(guān)鍵因素［2］。以往的研究大多采用免疫組織化學(xué)染色或RT－PCR半定量技術(shù)，這些方法在定量方面仍有缺陷。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是用于mRNA擴(kuò)增定量檢測(cè)的一項(xiàng)新技術(shù)，與RTRCR半定量分析、Northern印跡法等傳統(tǒng)mRNA定量方法相比，具有特異性高、穩(wěn)定性好和高通量等優(yōu)點(diǎn)。本研究通過實(shí)時(shí)定量檢測(cè)肝癌組織中ZHX2基因的表達(dá)情況，并同癌旁組織比較，分析其相對(duì)表達(dá)水平與肝癌臨床病理分級(jí)的關(guān)系，旨在為肝癌的臨床診斷、治療及預(yù)后提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例選擇

選擇2009年3月到2010年5月吉林大學(xué)第二附屬醫(yī)院首診的24例肝癌患者為研究對(duì)象，收集手術(shù)切除的肝癌新鮮癌組織標(biāo)本，取6例膽管結(jié)石手術(shù)切除的正常肝組織為對(duì)照，標(biāo)本均經(jīng)病理驗(yàn)證，所有研究對(duì)象均有知情同意權(quán)。標(biāo)本于手術(shù)摘除后5分鐘內(nèi)采集，生理鹽水沖洗后立即液氮保存。收集全部HCC患者的年齡、性別、腫瘤大小、病理分級(jí)（Edmondson標(biāo)準(zhǔn)）、血清AFP水平、門靜脈癌栓和肝病背景等臨床資料。

1.2 儀器和試劑

Trizol Reagent、Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Omniscirpt RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；ABI 7500熒光定量PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.3 引物及探針的設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中ZHX2的基因序列（gi：63079684），利用Primer Premier 5.0軟件輔助分析設(shè)計(jì)引物，ZHX2產(chǎn)物大小為194bp，上游引物為5’－GCCAGTGACCGCAAGAAGA－3’；下游引物為5’－GATTCGCTGGTGATGTGG－3’。由寶生物工程（大連）有限公司合成。

為對(duì)ZHX2mRNA的測(cè)定含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，使之具備可比性，需設(shè)置內(nèi)參照。GAPDH在各類組織細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平較為恒定，故以GAPDH作為內(nèi)參照。GAPDH產(chǎn)物大小為146bp，上游引物為5’－TCATGGGTGTGAACCATGAGAA－3；下游引物為5’－GGCATGGACTGTGGTCATGAG－3’。

1.4 總RNA的提取

采用Trizol法提取組織總RNA，所提取的RNA立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，方法按照Omniscirpt RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行，得到的cDNA保存于－20℃。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃、10s，60℃、45s，70℃、15s共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后95℃、10s，65℃延伸1min。溫度每上升1℃取5次熒光值制作熔解曲線，確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。在相同反應(yīng)條件下進(jìn)行ZHX2及GAPDH mRNA檢測(cè)，如果熔解曲線顯示無基因擴(kuò)增特異性信號(hào)，則認(rèn)為其不表達(dá)該基因。每個(gè)反應(yīng)設(shè)4個(gè)復(fù)孔，結(jié)果為3次實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.6 結(jié)果判斷及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

RT－PCR擴(kuò)增曲線陽性標(biāo)本呈現(xiàn)典型的S型曲線，而陰性對(duì)照是一條不規(guī)則的波浪線。熒光定量檢測(cè)結(jié)果用SDS軟件進(jìn)行分析，并用RQ＝2－ΔΔCt公式計(jì)算相對(duì)表達(dá)，Ct為循環(huán)閥值，ΔCt＝樣品Ct均值－內(nèi)參照Ct均值，ΔΔCt＝ΔCt－（隨機(jī)陰性對(duì)照樣品Ct均值－該樣品內(nèi)參照Ct均值），以2－ΔΔCt表示樣品中目的基因初始cDNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 肝組織總RNA提取結(jié)果

標(biāo)本經(jīng)Trizol法提取總RNA后，分別測(cè)定A260／A280，總體比值范圍在1.73±0.24，說明總RNA質(zhì)量較好。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見清晰的28s和18s主帶，說明總RNA無降解，無DNA污染，如圖1所示。

圖1 組織標(biāo)本總RNA提取結(jié)果

2.2 FQ－PCR結(jié)果

ZHX2mRNA的RT－PCR擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)典型的S型曲線（圖2A），熔解曲線分析可見只有單峰值，排除了非特異性擴(kuò)增（圖2B）。內(nèi)參GAPDH mRNA的RT－PCR擴(kuò)增曲線也呈現(xiàn)典型的S型曲線（圖2A），熔解曲線分析可見只有單峰值，排除了非特異性擴(kuò)增（圖2B）。表明所建立的ZHX2mRNA的熒光定量方法特異性較好。

2.3 HCC組織及癌旁肝組織中ZHX2基因mRNA的表達(dá)

圖2 ZHX2及GAPHD FQ－PCR結(jié)果

圖3 組織樣品ZHX2及GAPHD FQ－PCR結(jié)果

HCC組織及癌旁肝組織中ZHX2基因mRNA的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，在6例正常肝組織中均有表達(dá)；在HCC癌組織中ZHX2mRNA的陽性率為33.3%（8／24），癌旁非瘤組織中ZHX2mRNA的陽性率為62.5%（15／24）；ZHX2mRNA 在 HCC及癌旁組織中的陽性表達(dá)率無差異（χ2＝0.2432，P＞0.05）；但ZHX2mRNA在 HCC組織中的表達(dá)明顯低于對(duì)應(yīng)的癌旁肝組織，差異具有顯著性（P＜0.05，表1）。

表1 HCC及癌旁組織中ZHX2基因mRNA表達(dá)的分析

2.4 ZHX2的表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系

將HCC按不同的臨床病理特征分組比較ZHX2mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，ZHX2mRNA的表達(dá)與HCC患者的性別、年齡、分化程度、腫瘤大小、有無靜脈浸潤(rùn)以及肝硬化程度無關(guān)，而與有無肝外轉(zhuǎn)移灶、HBV感染和血清AFP值有關(guān)（表2）。

在所取的24例肝癌中，有2例門靜脈主干癌栓和2例肝門部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。對(duì)這4例HCC轉(zhuǎn)移灶的檢測(cè)顯示，其ZHX2基因mRNA的表達(dá)水平較HCC肝內(nèi)病灶高，差異有顯著性（P＜0.01）。

對(duì)收集的24例HCC標(biāo)本按HBV感染情況進(jìn)行分類，檢測(cè)兩組中ZHX2的mRNA水平，檢測(cè)結(jié)果經(jīng)軟件分析，以GAPDH為內(nèi)對(duì)照，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，HBV陽性組中ZHX2的整體表達(dá)水平低于 HBV陰性組（P＜0.01）。

表2 ZHX2mRNA的表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系

ZHX2mRNA與AFP血清水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，ZHX2mRNA在血清AFP＜400ng／ml的HCC組織中的表達(dá)水平明顯高于血清AFP≥400ng／ml的 HCC組織（P＜0.01）。

3 討論

ZHX2mRNA長(zhǎng)度約4.4kb，在肝、腦、肺等組織中均廣譜表達(dá)，但其在卵巢、前列腺、骨骼肌、脾、胰組織中表達(dá)水平相對(duì)更高［3］。近期研究顯示ZHX2可能參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，ZHX2不僅抑制肝癌細(xì)胞AFP的表達(dá)，而且在腎病綜合征中參與腎小球內(nèi)足細(xì)胞的調(diào)控［4］，另有研究顯示ZHX2表達(dá)與多發(fā)性骨髓瘤惡性程度及患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)［5］。上述研究提示ZHX2可能成為一個(gè)重要的抑癌基因。

本研究發(fā)現(xiàn)，ZHX2基因的mRNA在正常肝組織中均有表達(dá)，ZHX2mRNA在HCC及癌旁組織中的陽性表達(dá)率無差異，但ZHX2mRNA在HCC組織中的表達(dá)明顯低于對(duì)應(yīng)的癌旁肝組織；ZHX2 mRNA的表達(dá)與HCC患者的性別、年齡、分化程度、腫瘤大小、有無靜脈浸潤(rùn)以及肝硬化程度無關(guān)，而與有無肝外轉(zhuǎn)移灶、HBV感染和血清AFP值有關(guān)。ZHX2基因mRNA在肝外轉(zhuǎn)移灶和門靜脈主干癌栓中表達(dá)升高。本研究檢測(cè)了ZHX2mRNA的表達(dá)，結(jié)果表明ZHX2基因mRNA的表達(dá)在HCC中高于癌旁肝組織，其在低分化HCC中的表達(dá)高于高分化HCC，這提示ZHX2基因可能不僅與肝癌的發(fā)生有關(guān)，而且與肝癌的惡性程度也有關(guān)。本研究結(jié)果提示，ZHX2基因參與了HCC的發(fā)生和發(fā)展，同時(shí)ZHX2基因的過量表達(dá)與HCC的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，ZHX2基因有可能成為反映HCC侵襲轉(zhuǎn)移能力的新指標(biāo)。

應(yīng)用定量PCR技術(shù)檢測(cè)目的基因mRNA定量表達(dá)，其前提是樣本間細(xì)胞起始數(shù)、RNA提取效率、反轉(zhuǎn)錄效率和目的基因擴(kuò)增效率均需相同，然而以上條件不可能同時(shí)滿足，必須用管家基因?qū)颖具M(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，管家基因在細(xì)胞或基因組中的拷貝數(shù)被視為恒定，可用于代表樣本中所含細(xì)胞或基因組的數(shù)量［6］。本研究首次利用定量PCR檢測(cè)ZHX2基因mRNA在HCC中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)盡管ZHX2在HCC及癌旁組織中均有較高的表達(dá)頻率，但HCC中ZHX2mRNA水平明顯低于對(duì)應(yīng)的癌旁組織。

ZHX2廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物不同組織，其表達(dá)調(diào)控機(jī)制迄今尚不清楚。2006年，lv等［7］在研究HCC甲基化過程中發(fā)現(xiàn)了在多數(shù)HCC組織標(biāo)本中存在的一個(gè)廣泛的甲基化區(qū)域，同源性分析證實(shí)該區(qū)域是ZHX2啟動(dòng)子區(qū)；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)HepG2細(xì)胞中去甲基化可以恢復(fù)ZHX2表達(dá)，提示甲基化是ZHX2表達(dá)調(diào)控的機(jī)制之一。本課題組對(duì)ZHX2與HCC發(fā)病機(jī)制研究中，同時(shí)采用變性高效液相色譜法對(duì)HCC中ZHX2啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平與ZHX2mRNA表達(dá)水平及與HCC發(fā)生發(fā)展相互關(guān)系進(jìn)行了研究（另文發(fā)表），結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正常肝組織未檢測(cè)到ZHX2基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化，而24例HCC癌組織中有11例（45.8%）存在甲基化，提示該甲基化是腫瘤相關(guān)性的。另外，有16.6%癌旁肝組織也能檢測(cè)到甲基化，但明顯低于癌組織，有可能是由于癌旁肝組織存在不同程度的肝硬化或慢性炎癥，而并非完全正常肝組織，但也說明該甲基化有可能在HCC發(fā)生的早期或者其癌前病變時(shí)就已經(jīng)出現(xiàn)。

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