慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾增殖誘導(dǎo)配體基因抑制胃癌細(xì)胞增殖

蒿姍姍，李 薇，王 暢，崔久嵬

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院 腫瘤中心，吉林 長(zhǎng)春130021）

胃癌（GC）是世界第二大致癌癥相關(guān)死亡的最常見(jiàn)的原因之一，也是我國(guó)最常見(jiàn)的惡行腫瘤之一。近年來(lái)，胃癌的發(fā)病呈上升趨勢(shì)，探討其發(fā)病機(jī)制對(duì)其診治具有重要意義。

增 殖 誘 導(dǎo) 配 體 （APRIL）（又 稱 TALL－2，TRDL1，或TNFSF13）是腫瘤壞死因子（TNF）家族的一個(gè)成員。它最初確定是1998年由Hahne等［1］首先發(fā)現(xiàn)，因刺激腫瘤細(xì)胞的增殖而得名。APRIL在正常組織的表達(dá)很弱，但在多種腫瘤細(xì)胞和組織，如肺癌、黑色素瘤［2］，特別是胃腸道腫瘤有高水平表達(dá)［1，3］。在本項(xiàng)研究中，我們通過(guò)構(gòu)建 APRIL siRNA慢病毒載體并轉(zhuǎn)染人胃癌MGC803細(xì)胞，觀察其對(duì)MGC803細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響，以探討其在胃癌發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細(xì)胞系 MGC803（購(gòu)自ATCC）；大腸桿菌菌株DH5α、293T細(xì)胞（本實(shí)驗(yàn)室保存）；RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清（Gibco公司）；M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega公司）；Lipofectamine 2000、Trizol試劑盒（Invitrogen公司）；限制性內(nèi)切酶、PCR試劑盒 （TaKaRa公 司）；MTT、核 糖 核 酸 酶 （Sigma－Aldrich公司）；慢病毒載體pLVTHM、psPAX2、pMD2.G（均購(gòu)自Biovector Science Lab）。

1.2 方法

1.2.1 APRIL siRNA慢病毒載體質(zhì)粒的設(shè)計(jì)與構(gòu)建 根據(jù)人APRIL基因mRNA序列（NCBI Reference Sequence：NM＿172088.1），通過(guò)siRNA“Target Finder Tool”設(shè)計(jì)軟件（GenScrip公司網(wǎng)站提供）設(shè)計(jì)針對(duì)目的基因ARPIL的干擾序列：5’－aaTCCAGGATGCTGGAGTTTA－3’，同時(shí)設(shè)計(jì)陰性 對(duì) 照 序 列 （nonsilencing，NS）：5’－TTCTCCGAACGTGTCACGT－3’。通 過(guò) BLAST 同 源 性分析，排除了干擾序列非特異性抑制其他基因序列的可能。用化學(xué)合成法合成DNA寡核苷酸，退火，并插入到包含綠色熒光蛋白（GFP）的慢病毒載體pLVTHM中，最后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。對(duì)長(zhǎng)出的單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定，并通過(guò)限制性內(nèi)切酶分析及DNA測(cè)序鑒定。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與慢病毒的制備與轉(zhuǎn)染 人胃癌細(xì)胞MGC803和293T細(xì)胞，于含有10%胎牛血清、100U／ml青霉素和100mg／ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。按Lipofectamine 2000使用說(shuō)明，將重組的慢病毒質(zhì)粒與輔助載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h后，收集含有APRIL siRNA和非特異性序列的siRNA慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，然后確定此病毒的滴度。測(cè)得MGC803細(xì)胞在重組慢病毒轉(zhuǎn)染3天后的感染復(fù)數(shù)（MOI）為20。

1.2.3 RT－PCR 檢測(cè) APRIL mRNA 的表達(dá) 應(yīng)用Trizol試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書對(duì)MGC803細(xì)胞提取總RNA。根據(jù)說(shuō)明書，加入M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶42℃，反應(yīng)60min。APRIL mRNA的表達(dá)通過(guò)SYBR green PCR master mix分析，反應(yīng)如下：95℃15s，95℃5s，45個(gè)循環(huán)，60℃30s。引物設(shè)計(jì)如下：APRIL正義鏈：5＇－GGTATCCCTGGCAGAGTC－3＇；反義鏈：5＇－CTGTCACATCGGAGTCATC－3’和humanβ－actin：正 義 鏈：5＇－GGCGGCACCACCATGTACCCT－3＇；反 義 鏈：5＇－AGGGGCCGGACTCGTCATACT－3＇。以管家基因β－actin APRIL的循環(huán)閾值為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，測(cè)定APRIL的表達(dá)。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.4 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取Lenti－siAPRIL和Lenti－NS轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞，分別接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μl（含細(xì)胞數(shù)為2 000），每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至第1，2，3，4和第5天后，各孔分別加入20μl（5mg／ml）的MTT，繼續(xù)孵育4h。吸棄培養(yǎng)上清，加入150μl二甲基亞砜（DMSO），充分混合10min，用酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)定OD值。計(jì)算各組3個(gè)復(fù)孔的平均值，繪制計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期變化 收集轉(zhuǎn)染效率在80%以上的細(xì)胞，用D－Hanks液清洗，70%的預(yù)冷乙醇固定，4℃，1h。PBS洗滌2次，加入50 μg／ml的PI和100μg／ml的 RNase，室溫，避光5 min后，用流式細(xì)胞儀測(cè)定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS13.0軟件，組間比較用方差分析，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡觀察重組慢病毒轉(zhuǎn)染的效率

重組慢病毒轉(zhuǎn)染MGC803細(xì)胞72h后，通過(guò)熒光顯微鏡可觀察轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，在470－490 nm光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光（圖1）。轉(zhuǎn)染效率超過(guò)90%，說(shuō)明慢病毒包裝成功，且轉(zhuǎn)染效率較高。

圖1 熒光顯微鏡觀察重組慢病毒轉(zhuǎn)染的效率

2.2 Lenti－siAPRIL對(duì)APRIL基因表達(dá)的影響

本研究對(duì)非特異序列載體轉(zhuǎn)染組和Lenti－siAPRIL的APRIL mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。如圖2所示：Lenti－siAPRIL轉(zhuǎn)染MGC803細(xì)胞的APRIL mRNA水平均顯著減少68.1%（P＜0.01）。

2.3 Lenti－siAPRIL對(duì)細(xì)胞增殖的影響

Lenti－siAPRIL轉(zhuǎn)染的 MGC803細(xì)胞與Lenti－NS轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分別在第2，3，4和5天后檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示（圖3）：與Lenti－NS組相比，Lenti－siAPRIL轉(zhuǎn)染細(xì)胞組的增殖能力明顯下降（P＜0.05）

圖2 RT－PCR對(duì)APRIL基因干擾效果的檢測(cè)

圖3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

2.4 Lenti－siAPRIL對(duì)細(xì)胞周期的影響

我們對(duì) Lenti－NS轉(zhuǎn)染組和 Lenti－siAPRIL 轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染3d后進(jìn)行了流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。在圖4中，與對(duì)照組相比，Lenti－siAPRIL組的細(xì)胞在S期和G2／M期細(xì)胞周期階段的百分比增加；而在G0／G1期細(xì)胞比例顯著降低。提示Lenti－siAPRIL組胃癌細(xì)胞增殖被阻滯在G2／M期。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

3 討論

目前，胃癌仍然是威脅人類健康的重要?dú)⑹郑谌狈?duì)胃癌的早期診斷和檢測(cè)策略的情況下，胃癌的預(yù)后仍然較差［4］。在癌癥發(fā)展過(guò)程中，基因異常經(jīng)常可以監(jiān)測(cè)到，例如：基因突變或者參與腫瘤的生存、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的基因擴(kuò)增。對(duì)于胃癌，一系列特定基因（癌基因和抑癌基因）突變已被發(fā)現(xiàn)，其中包括APRIL 基因［5］。

APRIL作為腫瘤壞死因子（TNF）家族的新成員，它在動(dòng)物模型中顯示出促進(jìn)腫瘤增殖的作用，例如：APRIL過(guò)度表達(dá)誘導(dǎo)B細(xì)胞淋巴瘤［6］。然而，APRIL促進(jìn)腫瘤增殖并不局限于B細(xì)胞淋巴瘤。事實(shí)上，APRIL對(duì)實(shí)體瘤也提供生存／增殖信號(hào)。雖然并未在體外檢測(cè)到，但這種APRIL在腫瘤細(xì)胞過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象，已在體內(nèi)觀察到［7－9］。

RNA干涉（RNAi）是雙鏈 RNA（double－stranded RNA，dsRNA）引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。以某個(gè)基因?yàn)榘袠?biāo)的dsRNA被導(dǎo)入宿主細(xì)胞，可以使其mRNA發(fā)生特異性降解，導(dǎo)致相應(yīng)的基因沉默［10］。慢病毒是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，其最大的特點(diǎn)是轉(zhuǎn)染分裂期細(xì)胞的同時(shí)，還可以轉(zhuǎn)染非分裂期細(xì)胞，并可在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)［11］。

在這項(xiàng)研究中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們構(gòu)建的Lenti－siAPRIL慢病毒質(zhì)粒能有效地轉(zhuǎn)染人胃癌MGC803細(xì)胞。與非特異序列轉(zhuǎn)染組相比，LentisiAPRIL組顯著抑制了APRILmRNA表達(dá)；同時(shí)，Lenti－siAPRIL能抑制細(xì)胞增殖，提示：APRIL可調(diào)節(jié)GC細(xì)胞的增殖。此外，APRIL基因的沉默導(dǎo)致在S期和G2／M期細(xì)胞比例顯著增加，這表明，APRIL siRNA抑制細(xì)胞增殖，通過(guò)將細(xì)胞阻滯在G2／M期。APRIL通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期發(fā)揮其作用，這種調(diào)節(jié)作用的進(jìn)一步研究，將有助于我們更好地理解胃癌的分子機(jī)制。

綜上所述，我們成功構(gòu)建了人APRIL慢病毒siRNA干擾載體，且驗(yàn)證了慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾能夠有效抑制APRIL的表達(dá)。慢病毒介導(dǎo)的siRNA有效地抑制細(xì)胞增殖，且細(xì)胞周期被阻滯在G2／M期。該研究對(duì)后繼的APRIL基因?yàn)榘悬c(diǎn)的胃癌的治療研究奠定了基礎(chǔ)。

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