慢性不可預(yù)知性應(yīng)激對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎預(yù)后的影響

趙雅娟，張 旻，黃 飛，崔 敏，陳永進(jìn)

(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710032)

牙周炎以牙菌斑為啟動(dòng)因子，宿主的自身免疫反應(yīng)是加重牙周炎發(fā)展、導(dǎo)致牙周組織損害的重要因素［1］。相關(guān)流行病學(xué)研究已表明，應(yīng)激作為一種不良因素，能夠影響機(jī)體的免疫反應(yīng)，在牙周炎的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用［2］。然而，在牙周炎經(jīng)過(guò)基礎(chǔ)治療后的維護(hù)和愈合過(guò)程中，應(yīng)激是否也會(huì)起到作用，目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究擬通過(guò)建立大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型，同時(shí)給予復(fù)合性心理應(yīng)激，探討應(yīng)激對(duì)牙周炎預(yù)后的影響，進(jìn)一步為臨床上與心理因素有關(guān)的牙周炎的發(fā)生發(fā)展及干預(yù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和設(shè)備

雄性Sprague-Dawley大鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供);4-0醫(yī)用編織絲線(強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司);氟西汀注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字H12020957，天津金耀氨基酸有限公司);大鼠皮質(zhì)酮(Corticosterone)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司);RD1412-OF曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱、RD1208-EP高架十字迷宮(上海Mobile-datum公司)。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.1 大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型的建立

取5 周齡，平均體質(zhì)量(247.24 ±11.06)g SD大鼠128只，采用完全隨機(jī)分組法取32只作為正常對(duì)照組(A)，其余96只建立實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型。參照文獻(xiàn)［3］，大鼠經(jīng)10 g/L戊巴比妥鈉3.5 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定，4-0醫(yī)用無(wú)菌絲線結(jié)扎每只大鼠右上頜第二磨牙頸部，絲線保留4周。A組大鼠僅實(shí)施假手術(shù)而無(wú)絲線結(jié)扎。各組大鼠均于第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SPF級(jí))統(tǒng)一飼養(yǎng)，環(huán)境溫度(22±1)℃，相對(duì)濕度(60±5)%，12 h晝夜循環(huán)照明。實(shí)驗(yàn)第4周，測(cè)量絲線結(jié)扎大鼠雙側(cè)第二磨牙齦溝出血指數(shù)(SBI)，頰面近中、中央、遠(yuǎn)中牙周探診深度 (PD)并取均值，用以驗(yàn)證牙周炎模型。

1.2.2 動(dòng)物分組和應(yīng)激處理

牙周炎模型建立完成后的96只大鼠隨機(jī)分為牙周炎對(duì)照組(B)、牙周炎+心理應(yīng)激組(C)、牙周炎+心理應(yīng)激+應(yīng)激對(duì)抗藥物組(D)，加上正常對(duì)照組(A)共4組。各組按照實(shí)驗(yàn)時(shí)間再隨機(jī)分為4、5、6、8周4個(gè)亞組，每組8只。從第5周起，C、D組大鼠每日給予慢性不可預(yù)知性應(yīng)激處理。應(yīng)激方法參照文獻(xiàn)［4-5］并進(jìn)行部分改進(jìn):禁食(24 h)、禁水(24 h)、45 ℃強(qiáng)迫浸水(5 min)、4 ℃強(qiáng)迫浸水(5 min)、潮濕墊料(24 h)、晝夜顛倒(24 h)、束縛(1 h)。以上7種應(yīng)激因子按隨機(jī)化方法每日應(yīng)用其中之一，使動(dòng)物不能預(yù)料刺激的發(fā)生，以免產(chǎn)生適應(yīng)性。其中D組大鼠在應(yīng)激處理的同時(shí)每日按5 mg/kg腹腔注射氟西汀。A、B組大鼠不作任何處理，與C、D組相同條件下飼養(yǎng)。

1.3 應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)測(cè)量

1.3.1 體質(zhì)量測(cè)量

分別于實(shí)驗(yàn)第4、5、6、8周結(jié)束時(shí)測(cè)量各組大鼠體質(zhì)量并計(jì)算其體質(zhì)量增長(zhǎng)率。

1.3.2 行為學(xué)測(cè)試［6］。

分別于實(shí)驗(yàn)第5、6、8周取各組大鼠進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)。每只大鼠測(cè)試完畢后，用200 mL/L乙醇徹底擦拭實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)部，以消除上一只測(cè)試大鼠氣味的影響。

1.3.2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(Open field test)

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱(100 cm×100 cm×80 cm)，為不透明樹(shù)脂玻璃材料制成，側(cè)壁為白色，箱底為黑色。測(cè)試時(shí)，將大鼠放入曠場(chǎng)中央，正上方數(shù)字?jǐn)z像機(jī)記錄每只大鼠在15 min內(nèi)中央活動(dòng)路程(cm)、總路程(cm)。

1.3.2.2 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(Elevated plus maze text)

高架十字迷宮為黑色不透明樹(shù)脂玻璃材料制成，共有4個(gè)臂(50 cm×10 cm)，成“十字”形狀，距離地面70 cm。測(cè)試時(shí)，將大鼠從中央格面向閉合臂放入。正上方數(shù)字?jǐn)z像機(jī)記錄每只大鼠在5 min內(nèi)進(jìn)入開(kāi)放臂和閉合臂的次數(shù)以及停留時(shí)間，結(jié)果以每只大鼠在開(kāi)放臂滯留時(shí)間百分比(%)與進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)百分比(%)來(lái)表示。

1.3.3 血清皮質(zhì)酮(Corticosterone，CORT)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)測(cè)定

分別于實(shí)驗(yàn)第5、6、8周結(jié)束時(shí)各組大鼠經(jīng)10 g/L戊巴比妥鈉3.5 mg/kg腹腔注射麻醉，心臟取血1.5 mL，于4 ℃下3000 r/min 離心15 min，取上清，-80℃保存。采用ELISA法測(cè)定血清皮質(zhì)酮、促腎上腺皮質(zhì)激素含量，具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4 組織學(xué)觀察與測(cè)量

分別于實(shí)驗(yàn)第4、5、6、8周結(jié)束時(shí)各組大鼠經(jīng)10 g/L戊巴比妥鈉3.5 mg/kg腹腔注射麻醉，100 g/L多聚甲醛心臟灌注固定，取右側(cè)磨牙區(qū)上頜骨，置于100 g/L多聚甲醛固定48 h，150 g/L EDTA脫鈣，石蠟包埋，制備牙長(zhǎng)軸近中遠(yuǎn)中方向連續(xù)切片5 μm，并確保第二磨牙近中遠(yuǎn)中根同時(shí)包含于切片內(nèi)。HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察牙周組織病理改變。形態(tài)學(xué)改變應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件量化。炎癥反應(yīng)程度用同等放大倍數(shù)下(×100)炎細(xì)胞浸潤(rùn)面積表示，牙槽骨喪失量用牙槽嵴頂冠方至釉牙骨質(zhì)界距離表示，附著喪失量用結(jié)合上皮冠方至釉牙骨質(zhì)界距離表示［7］(圖1)。在高倍視野下(×400)將牙周膜置于視野直徑，計(jì)算右上頜第二磨牙根分叉以及近中遠(yuǎn)中牙槽嵴頂向下3個(gè)高倍視野范圍內(nèi)破骨細(xì)胞數(shù)［8］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

圖1 組織學(xué)測(cè)量示意圖

2 結(jié)果

2.1 牙周炎模型建立情況

實(shí)驗(yàn)第4周，建立牙周炎模型大鼠右上頜第二磨牙(建模牙)牙齦紅腫，探診易出血，部分結(jié)扎處牙齦糜爛，根分叉暴露。而左上頜第二磨牙(對(duì)照牙)未見(jiàn)明顯牙周炎癥狀。建模牙齦溝出血指數(shù)和牙周探診深度明顯大于對(duì)照牙，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)(表1)。

表1 牙周炎模型牙SBI、PD測(cè)量結(jié)果()

表1 牙周炎模型牙SBI、PD測(cè)量結(jié)果()

*與對(duì)照牙相比P＜0.05

牙周指標(biāo) 對(duì)照牙 建模牙SBI 0.63 ±0.56 2.97 ±0.90*PD(mm) 0.24 ±0.07 0.91 ±0.12*

2.2 大鼠體質(zhì)量變化

實(shí)驗(yàn)第4周結(jié)束時(shí)，各組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)量無(wú)顯著差異(P＞0.05)。而在實(shí)驗(yàn)第5、6、8周結(jié)束時(shí)，C、D組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)量均明顯低于A、B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，B組與A組相比，各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。D組與C組相比，除在第8周體質(zhì)量增長(zhǎng)量高于 C組(P＜0.05)外，其他各時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)(表 2)。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)量比較(%，)

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)量比較(%，)

同一時(shí)間點(diǎn)各組相比，不同字母組間P＜0.05

時(shí)間(周) A組 B組 C組 D組4 50.06 ± 5.63a 51.16 ±6.76a 50.58 ±4.05a 50.18 ± 5.03a 5 62.51 ± 8.22a 63.91 ±7.96a 52.72 ±6.20b 54.61 ± 6.36b 6 74.52 ± 7.72a 74.12 ±7.25a 62.77 ±4.75b 64.98 ± 7.16b 8 103.06 ± 12.64a 106.31 ±8.61a 72.41 ±11.19b 88.71 ± 8.32c

2.3 行為學(xué)分析結(jié)果

2.3.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)第5、6、8周，各組大鼠中央活動(dòng)路程和活動(dòng)總路程兩指標(biāo)均以A、B組最高，其次為D組，C組最低。兩指標(biāo)在5周時(shí)，各組間相比均無(wú)顯著差異(P＞0.05);6周時(shí)，僅 C組與 A、B組相比P＜0.05;8周時(shí)，C、D 組與 A、B 組相比 P ＜0.05;C、D兩組相比中央活動(dòng)路程為P＜0.05，而活動(dòng)總路程為 P ＞0.05。A、B 兩組5、6、8 周相比，兩指標(biāo)均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。C、D兩組隨時(shí)間延長(zhǎng)，兩指標(biāo)均呈下降趨勢(shì)。C組中央活動(dòng)路程僅8周與5、6周相比P＜0.05，活動(dòng)總路程僅8周與5周相比P ＜0.05。D 組兩指標(biāo) 5、6、8周相比均為P ＞0.05(圖2～3)。

2.3.2 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)第5、6、8周，各組大鼠開(kāi)放臂滯留時(shí)間百分比和進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)百分比兩指標(biāo)均以A組和B組最高，其次為D組，C組最低。兩指標(biāo)在5周時(shí)，各組間相比P＞0.05;6周時(shí)，僅C組與A、B兩組相比 P＜0.05;8周時(shí)，C、D組與 A、B組相比P＜0.05;C、D兩組相比，開(kāi)放臂滯留時(shí)間百分比為 P ＜0.05，進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)百分比為P ＞0.05，A、B兩組 5、6、8周相比，兩指標(biāo)均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。C、D兩組隨時(shí)間延長(zhǎng)，兩指標(biāo)均呈下降趨勢(shì)。C組兩指標(biāo)5、6、8周相比 P＞0.05。D組開(kāi)放臂滯留時(shí)間百分比5、6、8周相比P＞0.05，進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)百分比僅8周與5周相比有顯著差異(P ＜0.05)(圖4～5)。

2.4 血清CORT、ACTH測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)第5、6、8周，各組大鼠CORT和ACTH兩指標(biāo)均以A組和B組最低，其次為D組，C組最高。兩指標(biāo)在5周時(shí)，各組間均無(wú)顯著差異(P＞0.05);6 周時(shí)，C、D 組與 A、B 組 相比P ＜0.05，C、D 組之間，A、B 組之間則為 P ＞0.05;8周時(shí)，C、D 組與 A、B 組相比 P ＜0.05，C、D 兩組相比P ＜0.05。A、B 兩組 5、6、8 周相比，兩指標(biāo)均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。C、D兩組隨時(shí)間延長(zhǎng)，兩指標(biāo)均呈上升趨勢(shì)。C組CORT僅8周與5周相比P ＜0.05，ACTH 5、6、8 周兩兩比較 P ＜ 0.05。D組CORT僅8周與5周相比P＜0.05，ACTH在8周與5、6周之間相比P＜0.05(圖6～7)。

圖2 各組大鼠中央活動(dòng)路程

圖3 各組大鼠活動(dòng)總路程

圖4 各組大鼠在開(kāi)放臂滯留時(shí)間百分比

圖5 各組大鼠進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)百分比

圖6 各組大鼠血清CORT含量

圖7 各組大鼠血清ACTH含量

2.5 組織學(xué)分析

2.5.1 炎癥反應(yīng)

A組大鼠上頜第二磨牙牙周組織正常，牙齦上皮結(jié)構(gòu)完整，上皮下未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，牙齦、牙周膜纖維排列整齊，牙槽骨形態(tài)完整，未見(jiàn)明顯吸收(圖8 a，e)。炎細(xì)胞浸潤(rùn)面積 4、5、6、8 周之間無(wú)顯著差異(P ＞0.05)。實(shí)驗(yàn)第4周，B、C、D 組可見(jiàn)牙齦上皮釘突增生，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，牙齦、牙周膜纖維排列紊亂，結(jié)合上皮向根方增殖，牙槽骨高度降低，骨小梁稀疏(圖8 b～d)，炎細(xì)胞浸潤(rùn)面積顯著大于 A 組(P＜0.05)。5～8周，B、C、D組炎癥浸潤(rùn)面積均逐漸減小(圖8 f～h)。5周時(shí)，B、C、D組與 A 組相比有顯著差異(P＜0.05);而第6周，B、D組雖大于 A 組(P＜0.05)，卻顯著小于C組(P＜0.05);8周時(shí)，B組與A組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)，C組仍顯著大于 B、D組(P ＜0.05)(表 3)。

2.5.2 牙槽骨吸收、附著喪失

A組大鼠右上頜第二磨牙未見(jiàn)明顯牙槽骨吸收，結(jié)合上皮附著于釉牙骨質(zhì)界附近(圖8 a，e)，牙槽骨吸收、附著喪失兩指標(biāo)在4、5、6、8周之間無(wú)顯著差異(P ＞0.05)。實(shí)驗(yàn)第4周，B、C、D組可見(jiàn)牙槽骨明顯吸收，附著喪失明顯增加(圖8 b～d)，與A組相比 P＜0.05。5～8周，B、C、D 組可見(jiàn)牙槽骨重新形成、改建，上皮再附著(圖8 f～h)，且兩指標(biāo)均逐漸減小，以B組減小幅度最大，D組次之，C組最小。5周時(shí)，B、C、D組兩指標(biāo)與A組相比P＜0.05;6周時(shí)，B、D組牙槽骨喪失與A組相比P ＞0.05，但顯著小于 C 組(P ＜0.05)，附著喪失B、C、D 組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)，但顯著大于 A組(P＜0.05);8周時(shí)，B、D組牙槽骨喪失與A組相比P ＞0.05，顯著小于 C 組(P ＜0.05)，附著喪失B、C、D組顯著大于 A 組(P＜0.05)，且 C組顯著大于B組(P＜0.05)(表4～5)。

2.5.3 破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)

A 組破骨細(xì)胞數(shù)在4、5、6、8周均較少(圖9 i，m)，且組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)第4周，B、C、D組破骨細(xì)胞數(shù)明顯多于 A組(P＜0.05)(圖9 j～l)。5～8周，B、C、D 組可見(jiàn)新骨形成，破骨細(xì)胞數(shù)逐漸減少(圖9 n～p)，以B組減小幅度最大，D組次之，C組最小。5周時(shí)，B、C、D組與A組相比P＜0.05;6周時(shí)，B、D 組與 A 組相比P＞0.05;C組多于 A、B 組(P ＜0.05);8周時(shí)，C組多于 A、B、D 組(P ＜0.05)，A、B、D 組間無(wú)顯著差異(P ＞0.05)(表6)。

表3 各組炎細(xì)胞浸潤(rùn)面積比較(μm2，)

表3 各組炎細(xì)胞浸潤(rùn)面積比較(μm2，)

時(shí)間(周) A組 B組 C組 D組4 77.40 ±18.18Aa 544.78 ±104.38Ba 532.72 ±110.35Ba 549.72 ±124.23Ba 5 83.30 ±20.56Aa 317.16 ±73.62Bb 364.18 ±79.79Bb 309.56 ±68.05Bb 6 87.05 ±16.15Aa 145.06 ±36.06Bc 231.92 ±50.84Cc 177.42 ±42.71Bc 8 71.11 ±17.90Aa 106.10 ±19.22ABc 207.22 ±46.05Cc 123.62 ±23.19Bc

表4 各組牙槽骨吸收量比較(μm，)

表4 各組牙槽骨吸收量比較(μm，)

時(shí)間(周) A組 B組 C組 D組4 23.6 ±6.19Aa 71.8 ±11.17Ba 66.6 ±13.20Ba 72.2 ±7.92Ba 5 24.2 ±7.40Aa 60.6 ±10.48Ba 70.8 ±13.66Ba 64.6 ±13.18Ba 6 23.6 ±7.23Aa 33.8 ±11.12Ab 50.6 ±8.11Bb 37.8 ±9.81Ab 8 21.4 ±7.57Aa 29.2 ±7.26Ab 44.6 ±10.76Bb 30.0±9.35Ab

表5 各組附著喪失比較(μm，)

表5 各組附著喪失比較(μm，)

時(shí)間(周) A組 B組 C組 D組4 4.2 ±1.64Aa 88.6 ± 18.28Ba 87.8 ±11.82Ba 82.0 ±17.87Ba 5 3.8 ±1.64Aa 80.6 ± 15.73Ba 76.8 ±15.93Bab 78.2 ±13.0Ba 6 4.0 ±1.87Aa 55.6 ± 12.74Bb 73.0 ±19.86Bab 58.6 ±13.96Bab 8 3.6 ±1.67Aa 35.8 ± 8.23Bc 57.8 ±12.79Cb 46.2 ±15.51BCb

表6 各組破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(個(gè)，)

表6 各組破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(個(gè)，)

表3～6中，大寫(xiě)字母為同時(shí)間組間相比P＜0.05;小寫(xiě)字母為同組各時(shí)間點(diǎn)組間相比P ＜0.05

時(shí)間(周) A組 B組 C組 D組4 2.2 ±0.84Aa 7.8 ± 1.79Ba 7.4 ±1.95Ba 7.4 ±1.14Ba Ab 5 2.6 ±1.14Aa 5.8 ± 1.79Ba 6.4 ±1.52Bab 6.2 ±1.30Ba 6 1.8 ±0.84Aa 2.8 ± 0.84Ac 4.8 ±1.30Bb 3.4 ±1.14ABb 8 1.8 ±1.30Aa 2.2 ± 0.84Ac 4.4 ±1.34Bb 2.4 ±1.14

圖8 各組牙周組織學(xué)觀察(HE染色，×100，bar=150 μm)

圖9 各組破骨細(xì)胞情況(HE染色，×200，bar=100 μm)

3 討論

隨著社會(huì)的發(fā)展，生活壓力的增加，人類承受著越來(lái)越多生理與心理上的應(yīng)激。焦慮、抑郁、恐懼等不良心理狀態(tài)引起的各種機(jī)能和代謝變化，成為許多疾病重要的促進(jìn)因素。建立應(yīng)激動(dòng)物模型，對(duì)研究應(yīng)激相關(guān)疾病有重要幫助作用。目前，動(dòng)物心理應(yīng)激方法有多種，目的是將動(dòng)物置于不可避免的應(yīng)激環(huán)境中，誘發(fā)其應(yīng)激反應(yīng)［9-10］。一般認(rèn)為，機(jī)體受到心理應(yīng)激刺激時(shí)，下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)被激活，促進(jìn)垂體分泌促腎上腺皮質(zhì)激素，從而使糖皮質(zhì)激素分泌增多［11］。而當(dāng)一種應(yīng)激源反復(fù)刺激機(jī)體時(shí)，HPA軸會(huì)產(chǎn)生去敏作用，動(dòng)物表現(xiàn)為對(duì)刺激的耐受［12］。因此，為避免耐受，本研究采用慢性不可預(yù)知性應(yīng)激，其特點(diǎn)是使用多種不同的應(yīng)激方式，按照隨機(jī)化方法應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并且從病因角度更好的模擬了心理疾病的發(fā)生［4-5］。結(jié)果表明，慢性不可預(yù)知性應(yīng)激作用4周后，大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)減少，出現(xiàn)了焦慮、抑郁等行為異常表現(xiàn)，血清應(yīng)激性激素皮質(zhì)酮、促腎上腺皮質(zhì)激素含量增加，且未出現(xiàn)耐受的表現(xiàn)。

采用絲線結(jié)扎誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生牙周炎是目前公認(rèn)并且廣泛應(yīng)用的的牙周炎動(dòng)物模型之一［3，13］。絲線結(jié)扎的局部壓迫作用不僅能造成牙齦機(jī)械損傷，還能造成牙槽骨吸收;同時(shí)絲線能夠促進(jìn)局部菌斑形成與堆積，促進(jìn)組織炎癥反應(yīng)，最終形成牙周炎。本研究對(duì)大鼠右上頜第二磨牙進(jìn)行絲線結(jié)扎4周后，出現(xiàn)了明顯的牙周損害，齦溝出血指數(shù)與牙周探診深度與對(duì)側(cè)相比均明顯增加，組織切片表明結(jié)扎組出現(xiàn)牙槽骨喪失、牙齦炎癥、破骨細(xì)胞活躍等，證實(shí)了該方法的的可靠性。

牙周炎是一個(gè)慢性炎癥疾病，其病理發(fā)展分為活動(dòng)期與修復(fù)期，在病損進(jìn)展期，可見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，牙槽骨吸收破壞明顯，破骨細(xì)胞活躍，膠原纖維變性、溶解。在此階段，若機(jī)體同時(shí)受到心理應(yīng)激刺激，則會(huì)加重炎癥的進(jìn)程。有研究表明，心理應(yīng)激能夠影響牙周炎的發(fā)展［13-14］。而在經(jīng)過(guò)較系統(tǒng)的基礎(chǔ)治療后，牙周炎進(jìn)入修復(fù)愈合期，炎癥區(qū)有新生的成纖維細(xì)胞，可見(jiàn)新生毛細(xì)血管、纖維結(jié)締組織，而牙槽骨吸收處于靜止?fàn)顟B(tài)，破骨細(xì)胞較少，原有的牙槽嵴頂部以及骨吸收陷窩區(qū)又有類骨質(zhì)形成，牙根面的牙骨質(zhì)也出現(xiàn)新生現(xiàn)象。有研究證實(shí)，用絲線結(jié)扎建立大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型，在去除絲線后，牙周軟組織損傷出現(xiàn)自我修復(fù)，牙槽骨出現(xiàn)改建［15-16］。本研究采用同樣的方法模擬牙周炎從活動(dòng)期進(jìn)入修復(fù)期的過(guò)程，以觀察心理應(yīng)激對(duì)牙周炎愈合過(guò)程的影響。

有研究已表明［17］，心理應(yīng)激作為一種不良的外界因素，能夠影響機(jī)體免疫系統(tǒng)以及白細(xì)胞活性，改變細(xì)胞因子釋放水平，延遲成纖維細(xì)胞分化，從而延長(zhǎng)了皮膚、黏膜傷口的愈合時(shí)間。在牙周炎的維護(hù)階段，機(jī)體處于一個(gè)類似“從損傷到愈合”的階段，此時(shí)若牙周支持治療不完善，或受到局部或全身因素的影響，則極有可能引起病情反復(fù)。Axtelius等［18］發(fā)現(xiàn)，生活中承受更多心理壓力或具有消極性格的牙周病病人比社會(huì)壓力較少的病人牙周治療效果差，預(yù)后不佳。本結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，單純牙周炎組在沒(méi)有受到應(yīng)激刺激時(shí)，病變組織得到了較好的恢復(fù)，而施加應(yīng)激組則牙周組織修復(fù)較差，局部的炎癥消除明顯減慢，新生組織較少，牙槽骨仍可見(jiàn)部分破壞。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)［19］，皮質(zhì)激素與兒茶酚胺類受體的激活是心理應(yīng)激影響損傷愈合的重要原因。從本結(jié)果分析，心理應(yīng)激組的皮質(zhì)激素出現(xiàn)了明顯升高，這也可能是心理應(yīng)激影響牙周組織的修復(fù)、愈合進(jìn)程的重要因素之一。

實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激對(duì)抗藥物組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)較應(yīng)激組高，較少有行為異常表現(xiàn)，血清應(yīng)激激素水平較應(yīng)激組有所下降，牙周組織病變恢復(fù)亦較好。說(shuō)明藥物的應(yīng)用能減輕應(yīng)激的不良作用。Breivik等［20］研究表明，抗抑郁藥噻萘普汀應(yīng)用于抑郁模型大鼠，能夠減輕抑郁狀態(tài)對(duì)實(shí)驗(yàn)性牙周炎的影響。氟西汀屬于抗抑郁、抗焦慮的經(jīng)典藥物，當(dāng)機(jī)體受到應(yīng)激時(shí)，交感神經(jīng)興奮，腎上腺素、去甲腎上腺素分泌增多，HPA軸激活使糖皮質(zhì)激素分泌增多，抑制細(xì)胞免疫而增強(qiáng)體液免疫，改變了炎性細(xì)胞因子分泌狀態(tài)［7］，從而影響牙周炎的愈合過(guò)程。而氟西汀通過(guò)調(diào)節(jié)由應(yīng)激引起的神經(jīng)-內(nèi)分泌效應(yīng)，使大鼠機(jī)體免疫反應(yīng)趨于正常，減輕心理應(yīng)激以及其對(duì)牙周炎預(yù)后的不良影響。

本結(jié)果表明在牙周炎靜止期，慢性不可預(yù)知性應(yīng)激會(huì)影響牙周組織的愈合進(jìn)程，減慢炎癥的消除、骨組織的修復(fù)與重建，影響牙周炎的預(yù)后。藥物對(duì)抗能夠逆轉(zhuǎn)心理應(yīng)激對(duì)牙周炎愈合進(jìn)程的影響。

［1］Amano A.Host-parasite interactions in periodontitis:microbial pathogenicity and innate immunity［J］.Periodontol，2000.2010，54(1):9-14.

［2］Rosania AE，Low KG，McCormick CM，et al.Stress，depression，cortisol，and periodontal disease［J］.J Periodontol，2009，80(2):260-266.

［3］Huang S，Lu F，Zhang Z，et al.The role of psychologic stressinduced hypoxia-inducible factor-1α in rat experimental periodontitis［J］.J Periodontol，2011，82(6):934-941.

［4］Luo KR，Hong CJ，Liou YJ，et al.Differential regulation of neurotrophin S100B and BDNF in two rat models of depression［J］.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2010，34(8):1433-1439.

［5］Yang C，Wang G，Wang H，et al.Cytoskeletal alterations in rat hippocampus following chronic unpredictable mild stress and reexposure to acute and chronic unpredictable mild stress［J］.Behav Brain Res，2009，205(2):518-524.

［6］Li Q，Zhang M，Chen YJ，et al.Oxidative damage and HSP70 expression in masseter muscle induced by psychological stress in rats［J］.Physiol Behav，2011，104(3):365-372.

［7］Gaspersic R，Stiblar-Martincic D，Skaleric U.Influence of restraint stress on ligature-induced periodontitis in rats［J］.Eur J Oral Sci，2002，110(2):125-129.

［8］葛姝云，李德懿.應(yīng)激對(duì)豚鼠牙周炎模型的影響［J］.上?？谇会t(yī)學(xué)，2003，12(1):30-33.

［9］Agrawal A，Jaggi AS，Singh N.Pharmacological investigations on adaptation in rats subjected to cold water immersion stress［J］.Physiol Behav，2011，103(3-4):321-329.

［10］Peruzzo DC，Benatti BB，Antunes IB，et al.Chronic stress may modulate periodontal disease:a study in rats［J］.J Periodontol，2008，79(4):697-704.

［11］Wagner KV，Wang XD，Liebl C，et al.Pituitary glucocorticoid receptor deletion reduces vulnerability to chronic stress［J］.Psychoneuroendocrinol，2011，36(4):579-587.

［12］Rabasa C，Delgado-Morales R，Muňoz-Abellán C，et al.Adaptation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis and glucose to repeated immobilization or restraint stress is not influenced by associative signals［J］.Behav Brain Res，2011，217(1):232-239.

［13］杜建東，余占海，楊倩，等.實(shí)驗(yàn)性牙周炎動(dòng)物模型研究［J］.實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志.2007，23(6):801-804.

［14］Peruzzo DC，Benatti BB，Antunes IB，et al.Chronic stress may modulate periodontal disease:a study in rats［J］.J Periodontol，2008，79(4):697-704.

［15］Cetinkaya BO，Keles GC，Ayas B，et al.The expression of vascular endothelial growth factor in a rat model at destruction and healing stages of periodontal disease［J］.J Periodontol，2007，78:1129-1135.

［16］Coimbra LS，Rossa C Jr，Guimarǎes MR，et al.Influence of antiplatelet drugs in the pathogenesis of experimental periodontitis and periodontal repair in rats［J］.J Periodontol，2011，82(5):767-777.

［17］Horan MP，Quan N，Subramanian SV，et al.Impaired wound contraction and delayed myofibroblast differentiation in restraint-stressed mice［J］.Brain Behav Immun，2005，19(3):207-216.

［18］Axtelius B，S?derfeldt B，Nilsson A，et al.Therapy-resistantperiodontitis，psychosocial characteristics［J］.J Clin Periodontol，1998，25(6):482-491.

［19］Eijkelkamp N，Engeland CG，Gajendrareddy PK，et al.Restraint stress impairs early wound healing in mice via alpha-adrenergic but not beta-adrenergic receptors［J］.Brain Behav Immun，2007，21(4):409-412.

［20］Breivik T，Gundersen Y，Myhrer T，et al.Enhanced susceptibility to periodontitis in an animal model of depression:reversed by chronic treatment with the anti-depressant tianeptine［J］.J Clin Periodontol，2006，33(7):469-477.