胡 瑛 朱藍(lán)玉 張 冬 于增國▲
1.解放軍第二一○醫(yī)院檢驗(yàn)科,遼寧大連 116021;2.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系,遼寧大連 116622;3.大連市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科,遼寧大連 116000
急性腦梗死血小板活化狀態(tài)的檢測(cè)及臨床意義
胡 瑛1朱藍(lán)玉2張 冬3于增國2▲
1.解放軍第二一○醫(yī)院檢驗(yàn)科,遼寧大連 116021;2.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系,遼寧大連 116622;3.大連市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科,遼寧大連 116000
目的 探討急性腦梗死發(fā)病不同時(shí)期中血小板的活化狀態(tài)以及各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的相互關(guān)系與臨床意義。 方法 采用FCM測(cè)定52例腦梗死患者發(fā)病的急性期(發(fā)病1~3 d)和穩(wěn)定期(治療的10~14 d)血小板CD62p和CD63表達(dá)率,用玻球法測(cè)定PAdT,智能血液凝集儀測(cè)定PAgT,同時(shí)檢測(cè)正常對(duì)照組30例。 結(jié)果 腦梗死急性期CD62p和CD63表達(dá)率較穩(wěn)定期及正常對(duì)照組顯著上調(diào)(P<0.01);待病情穩(wěn)定時(shí)兩者表達(dá)均明顯下降,但亦較正常對(duì)照組增高(P<0.01),且CD62p和CD63表達(dá)呈著正相關(guān)(r=0.788,P=0.003);PAdT和PAgT在腦梗死急性期亦較正常對(duì)照組顯著升高(P<0.01),穩(wěn)定期則降至正常水平。 結(jié)論 CD62p、CD63的表達(dá)與PAdT、PAgT隨腦梗死病情演變而變化,兩者呈一致性,共同參與腦梗死發(fā)生、發(fā)展病理過程;CD62p、CD63表達(dá)比PAdT、PAgT能更加敏感而準(zhǔn)確地反映出血小板活化狀態(tài),且具有較高的一致性,可作為ACI診斷、病情監(jiān)測(cè)及判斷預(yù)后的重要指標(biāo)之一。
腦梗死;P-選擇素;溶酶體蛋白;血小板粘附率;血小板聚集率
急性腦梗死(ACI)是一種嚴(yán)重危害中老年人健康的缺血性腦損害性疾病。本病病因病機(jī)十分復(fù)雜,有研究表明,血小板的高活化狀態(tài)在腦梗死形成過程中具有重要作用,是發(fā)生ACI重要危險(xiǎn)因素之一[1-2]。為此,本研究擬通過對(duì)52例ACI患者發(fā)病不同時(shí)程的血小板黏附率(PAdT)、血小板聚集率(PAgT)和血小板P-選擇素(CD62P)、溶酶體蛋白(CD63)表達(dá)率的檢測(cè),進(jìn)一步研究腦梗死發(fā)病過程中血小板的活化狀態(tài),明確血小板各項(xiàng)活化功能檢測(cè)指標(biāo)的相互關(guān)系與臨床應(yīng)用價(jià)值,為深入研究ACI發(fā)病機(jī)制和建立實(shí)驗(yàn)室診斷敏感指標(biāo)提供科學(xué)的依據(jù)。
1.1 研究對(duì)象
腦梗死組:為2011年4月~2011年12月間筆者所在醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的腦梗死患者52例,其中男28例,女24例;年齡51~82 歲,平均(63.3±12.3)歲;臨床診斷符合全國第五屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的標(biāo)準(zhǔn),神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分(NDS):輕型16例,中型28例,重型8例。排除肝腎疾病、腫瘤、感染、自身免疫性疾病和代謝性疾病。發(fā)病前2周內(nèi)未服過阿斯匹林、潘生丁等影響血小板功能的藥物和其他抗凝藥物。
正常對(duì)照組:系30名來自筆者所在醫(yī)院同期健康體檢者,排除冠心病、高血壓、糖尿病史等,與腦梗死組在性別、年齡上比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
1.2 主要試劑與儀器
1.2.1 主要試劑 單克隆抗體CD62p-FITC、CD63-PE、IgG1-FITC、IgG1- PE,均購自法國Immunotech公司。
1.2.2 主要儀器 流式細(xì)胞儀(EPICS-XL型,美國Coulter公司)、血小板粘附儀(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血研究所產(chǎn)品)、血小板聚集儀(PEA3200型,日本科學(xué)株式會(huì)社產(chǎn)品)。
1.3 方法
1.3.1 采血時(shí)間與標(biāo)本制備 全部患者于發(fā)病的急性期(1~3 d)及穩(wěn)定期(治療的10~14 d)分別清晨空腹抽取靜脈血,用106 mmol/L枸緣酸鈉抗凝(血與抗凝劑比9∶1),以800 r/min離心5 min,取富含血小板血漿(PRP),用于CD62p與CD63測(cè)定。
1.3.2 CD62p與CD63測(cè)定 取200μL PRP以等體積2%甲醛固定,再用磷酸緩沖液(PBS)洗滌2~3次,調(diào)整血小板濃度為300×109/L,分別加入CD62p、CD63熒光單抗避光室溫混勻孵育30 min,然后用PBS洗滌1次后,加入0.5 mL PBS重懸,采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定中用CD41/sslog散點(diǎn)圖設(shè)門,流速控制在100~200 s,每份標(biāo)本測(cè)定5 000~10 000個(gè)血小板[3]。
1.3.3 PAdT測(cè)定 采用玻璃球旋轉(zhuǎn)法[4]。清晨空腹抽取患者肘靜脈血3.6 mL,以106 mmol/L枸緣酸鈉1∶9抗凝,搖勻后取1.0 mL加入血小板粘附儀中進(jìn)行檢測(cè)。
1.3.4 PAgT測(cè)定 采用比濁法[4]??崭?fàn)顟B(tài)下抽取患者肘靜脈血,抗凝后注入特制的硅化試管中,離心、制備PRP和PPP血漿,取0.5 mL PRP置于血小板聚集儀比濁管內(nèi),由微機(jī)自動(dòng)處理并記錄血小板聚集曲線,報(bào)告5 min血小板最大聚集率。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.5,數(shù)據(jù)采用方差分析進(jìn)行比較,以(± s)表示,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)分析采用直線相關(guān)分析(當(dāng)P<0.01時(shí)為正相關(guān))。
2.1 腦梗死組與正常對(duì)照組PAdT與PAgT的比較
檢測(cè)結(jié)果顯示,腦梗死組急性期(1~3 d)PAdT、PAgT較正常對(duì)照組顯著升高(P<0.01);而穩(wěn)定期(10~14 d)則降至正常水平。見表1。
表1 腦梗死患者不同時(shí)程PAdT、PAgT的變化比較(± s)
表1 腦梗死患者不同時(shí)程PAdT、PAgT的變化比較(± s)
注:與正常對(duì)照組比較,*P<0.01
組別 n PAdT(%) PAgT(%)腦梗死組(1~3 d) 52 60.12±11.50* 71.20±16.80*腦梗死組(10~14 d) 52 43.20±7.90 48.30±12.10正常對(duì)照組 30 41.70±8.59 49.75±18.98
2.2 腦梗死組與正常對(duì)照組CD62p、CD63表達(dá)率的比較
腦梗死組急性期CD62p、CD63表達(dá)率較正常對(duì)照組顯著上調(diào)(P<0.01);穩(wěn)定期二者表達(dá)率較急性期明顯下降(P<0.01),但仍較正常對(duì)照組增高(P<0.01)。見表2。
表2 腦梗死患者不同時(shí)程CD62p、CD63表達(dá)率的比較(± s)
表2 腦梗死患者不同時(shí)程CD62p、CD63表達(dá)率的比較(± s)
注:與對(duì)照組比較,*P<0.01;與穩(wěn)定期比較,**P<0.01
組別 n CD62p(%) CD63(%)腦梗死組(1~3 d) 52 9.01±1.69* 8.15±1.21*腦梗死組(10~14 d) 52 5.12±1.18** 4.03±1.15**正常對(duì)照組 30 1.48±0.46 0.89±0.41
2.3 血小板CD62p與CD63表達(dá)的相關(guān)性分析
經(jīng)采用直線相關(guān)分析,結(jié)果顯示腦梗死組血小板CD62p與CD63的表達(dá)二者呈顯著正相關(guān)(r=0.788,P=0.003)。
近年來,隨著“血栓與止血”研究的不斷深入,使血小板在多個(gè)系統(tǒng)疾病的病理生理作用機(jī)制不斷被發(fā)現(xiàn),為許多生命現(xiàn)象與病理過程增加了新的認(rèn)識(shí),尤其是血小板高活化狀態(tài)在缺血性腦損害過程中所起的作用,以及活化血小板的各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)相互關(guān)系及其應(yīng)用評(píng)價(jià),始終是研究的熱點(diǎn)之一。
眾所周知,血小板粘附功能和聚集功能是活化后血小板所表現(xiàn)出的兩大主要生理功能,是血小板進(jìn)一步活化、參與止血、促進(jìn)血液凝固的保證,也是血栓形成的重要基礎(chǔ)。早年,臨床上通常采用PAdT和PAgT作為血小板活化功能主要指標(biāo),已有諸多報(bào)道在腦梗死形成時(shí)活化的血小板粘附性和聚集性均明顯增高。本研究檢測(cè)結(jié)果亦顯示,腦梗死急性期,患者的PAdT和PAgT均較正常對(duì)照組顯著升高(P<0.01),而穩(wěn)定期二者則降至正常水平,表明在腦梗死急性期體內(nèi)存在高凝狀態(tài)和血小板的高度活化,這與劉姣[2]報(bào)道一致。
近年來,隨著血小板功能檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步,血小板的活化程度亦可采用血小板膜蛋白表達(dá)高低來判斷[5]。其中,最主要的是存在于血小板胞質(zhì)內(nèi)顆粒膜糖蛋白CD62p和CD63。CD62p為血小板α顆粒膜糖蛋白,亦稱P-選擇素;CD63是溶酶體顆粒糖蛋白53,又稱血小板溶酶體蛋白[6]。當(dāng)血小板活化時(shí),存在于血小板胞質(zhì)內(nèi)的CD62p和CD63被迅速動(dòng)員到細(xì)胞表面,介導(dǎo)并啟動(dòng)血小板與白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞粘附,引起血栓并加劇腦組織損傷。因此,CD62p、CD63成為檢測(cè)血小板活化程度及血栓形成可靠而特異的標(biāo)志物[7-8]。本研究檢測(cè)結(jié)果顯示,在腦梗死發(fā)病急性期CD62p與CD63表達(dá)均較對(duì)正常照組顯著上調(diào)(P<0.01),表明此時(shí)血小板功能異?;钴S并處于高度活化狀態(tài),直接參與腦梗死病理過程的早期階段。當(dāng)治療的第10~14天,病情處于穩(wěn)定期時(shí),CD62p與CD63的表達(dá)則明顯下降(P<0.01),說明CD62p與CD63的表達(dá)水平是隨著腦梗死病情演變過程而呈動(dòng)態(tài)變化。但仍較正常對(duì)照組高(P<0.01),可能系腦梗死尚未完全恢復(fù)血小板仍處于功能活躍狀態(tài)以及CD62p與CD63表達(dá)下降較為緩慢之故[9]。經(jīng)相關(guān)性分析顯示CD62p與CD63表達(dá)呈顯著直線正相關(guān)(r=0.788,P=0.003)。因此,兩者的表達(dá)不但與腦梗死病情演變密切關(guān)聯(lián),并且具有較高的一致性。
值得注意的是,通過本研究檢測(cè)結(jié)果分析還發(fā)現(xiàn),在腦梗死發(fā)病的急性期,PAdT、PAgT隨著CD62p與CD63表達(dá)上調(diào)而顯著增高,說明血小板的粘附功能和聚集功能與活化血小板胞質(zhì)內(nèi)顆粒膜糖蛋白表達(dá)是一致性。段金海等[10]研究證明,CD62p不僅對(duì)血小板粘附起促進(jìn)作用,并且對(duì)血小板聚集也具有重要作用。而在腦梗死穩(wěn)定期時(shí),雖然CD62p與CD63表達(dá)仍高于正常對(duì)照組(P<0.01),但PAdT、PAgT卻已降到正常水平,從而證明在腦梗死穩(wěn)定期時(shí)CD62p與CD63表達(dá)和PAdT、PAgT并不一致,提示PAdT、PAgT尚不能完全準(zhǔn)確地反映血小板活化狀態(tài)。因此,CD62p與CD63表達(dá)比PAdT、PAgT能更準(zhǔn)確地反映出腦梗死的病情變化與程度[11-12]。
總之,通過本研究檢測(cè)與分析,表明在腦梗死發(fā)病過程中體內(nèi)存在著血小板高度活化,并通過各種效應(yīng)直接參與缺血性腦損傷的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程,是ACI發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。血小板CD62p與CD63表達(dá)的檢測(cè)較比PAdT、PAgT能更加敏感的反映出體內(nèi)血小板活化狀況,從而準(zhǔn)確提示缺血性腦血管病的病理變化,對(duì)ACI臨床早期診斷、預(yù)防和治療、預(yù)測(cè)病情演變及指導(dǎo)臨床用藥均有重要意義。
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The detection of the platelet activation status of the acute cerebral infarction and its clinical significance
HU Ying1ZHU Lanyu2ZHANG Dong3YU Zengguo2
1.Department of Laboratory, the 210th Hospital of People's Liberation Army,Dalian 116021,China;2.Department of Laboratory,Dalian University of Medicine, Dalian 116622,China; 3. Department of Laboratory, Dalian City Chinese Medicine Hospital, Dalian 116000,China
ObjectiveThis article studies on the platelet activation status during the different phases of acute cerebral infarction and the relationship of indicators in various detections and tells us the clinic significance of the research.MethodsDetermining the expression level of the p-selectin(CD62P)and lysosome membrane protein(CD63)of platelet by FCM during the acute phase(1~3 d after the occurrence)and the stable phase(10~14 d of the treatment)of 52 cases of cerebral infarction,determining the PAdT by glass ball method, and determining the PagT by intelligent blood coagulation instrument and meanwhile detect 30 cases of normal control group.ResultsIn the acute phase of cerebral infarction,the expression level of CD62p and CD63 was significantly higher(P<0.01)than that of the stable phase and the normal control group.When the conditions of patients were stable,the expression level of CD62p and CD63 was significantly decreased but still higher than the normal control group(P<0.01),and the expression level of CD62p was obviously positively correlated with that of CD63(r=0.788,P=0.003).In the acute phase of cerebral infarction,PAdT and PagT were both significantly increased than that of the normal control group,but they return to normal level when the illness comes to the stable phase.ConclusionCD62p and CD63,PAdT and PAgT change with the progression of cerebral infarction and show great correspondence,and they all involve in the occurrence and development process of pathogenesis of cerebral infarction.The expression level of CD62p and CD63 with higher consistent was more sensitive and accurate than PAdT and PAgT in reflecting the platelet activation status,it can be used as an important indicator for ACI diagnosis,observation of the disease course and prediction of the prognosis.
Cerebral infarction;P-selectin;Lysosomal membrane protein53;PAdT and PAgT
R446.11+2
A
2095-0616(2012)12-108-03
▲通訊作者
2012-04-25)