3種ELISA試劑盒對(duì)牛新孢子蟲血清抗體比較檢測(cè)

季新成 哈 森 于學(xué)輝 史 茜

(新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局 新疆烏魯木齊 830063)

1 前言

新孢子蟲病是由犬新孢子蟲(Neospora Caninum)寄生于牛、羊、犬等多種動(dòng)物體內(nèi)引起的一種原蟲病。雖然該病是多種家畜共患，但對(duì)牛的危害尤為嚴(yán)重，主要造成母牛流產(chǎn)、產(chǎn)死胎以及新生兒的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)疾病。該病可垂直傳播，帶蟲母?？蓪⑾x體直接傳給新生犢牛［1－2］。新孢子蟲病呈世界性分布，已成為世界奶牛流產(chǎn)寄生蟲病研究的熱點(diǎn)［3］。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是檢測(cè)新孢子蟲血清抗體的常用方法，目前已有多種檢測(cè)該病的商品化ELSIA試劑盒，但各品牌良莠不齊，質(zhì)量如何，目前還沒有一個(gè)明確的評(píng)價(jià)。為了保證檢測(cè)質(zhì)量，更好的選擇適用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的試劑盒，本研究用目前國內(nèi)市場(chǎng)常用的3種試劑盒分別對(duì)澳大利亞、新西蘭、烏拉圭和我國新疆的牛血清進(jìn)行了比較檢測(cè)，以便為試劑盒的選用提供參考。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 血清

已知陽性血清、陰性血清各5份:購自美國IDVET公司各2份，3種商業(yè)化的ELISA試劑盒自帶各1份;

被檢血清157份:其中2010年11月從澳大利亞進(jìn)口牛血清41份，2011年4月從新西蘭進(jìn)口牛血清40份，2011年5月從烏拉圭進(jìn)口牛血清30份，2010年采自中國新疆46份。

2.1.2 試劑盒

3種商業(yè)化的ELISA試劑盒:①瑞典Svanova公司，間接ELISA試劑盒，批號(hào)P09566－AG463，適用于檢測(cè)牛血清或牛奶中犬新孢子蟲抗體;②美國IDEXX公司，間接ELISA試劑盒，批號(hào)P06662，適用于檢測(cè)牛血清中犬新孢子蟲抗體;③美國VMRD公司，競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒，批號(hào)P10302－007，適用于檢測(cè)牛血清和山羊血清中犬新孢子蟲抗體。

2.1.3 主要儀器及耗材

Elx800酶標(biāo)儀，Eppendorf各型號(hào)微量加樣器。

2.2 方法

分別進(jìn)行診斷相對(duì)敏感性試驗(yàn)、診斷相對(duì)特異性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、檢測(cè)低限測(cè)定，并對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)的操作與結(jié)果判定均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.2.1 診斷相對(duì)敏感性試驗(yàn)

本試驗(yàn)除對(duì)5份已知新孢子蟲陽性血清檢測(cè)外，還以其中的2個(gè)試劑盒檢測(cè)均為陽性的樣品認(rèn)定為真陽性，用另1個(gè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，確定該試劑盒的診斷相對(duì)敏感性。

對(duì)經(jīng)3個(gè)試劑盒檢測(cè)均為陽性的4份血清用陰性牛血清進(jìn)行2的倍數(shù)共5個(gè)系列的稀釋后，每1個(gè)稀釋度作為1份獨(dú)立樣品進(jìn)行檢測(cè)，確定試劑盒的檢測(cè)低限。

2.2.2 診斷相對(duì)特異性試驗(yàn)

本試驗(yàn)除對(duì)5份已知陰性血清檢測(cè)外，還以其中的2個(gè)試劑盒檢測(cè)均為陰性的樣品認(rèn)定為真陰性，用另1個(gè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，確定該試劑盒的診斷相對(duì)特異性。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

選擇10份樣品進(jìn)行4次重復(fù)檢測(cè)，計(jì)算測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)，確定試劑盒的重復(fù)性。

2.2.4 對(duì)樣品的檢測(cè)

用3個(gè)試劑盒分別對(duì)157份牛血清進(jìn)行檢測(cè)，比較試劑盒之間的符合率。

3 結(jié)果

3.1 診斷相對(duì)敏感性試驗(yàn)和診斷相對(duì)特異性試驗(yàn)

按以下公式分別計(jì)算診斷相對(duì)敏感性(DRSe)和診斷相對(duì)特異性(DRSp):

結(jié)果見表1、表2、表3，各試劑盒診斷相對(duì)敏感性和診斷相對(duì)特異性差異顯著(P＜0.01)。

表1 Svanova試劑盒診斷相對(duì)敏感性和診斷相對(duì)特異性檢測(cè)結(jié)果

表2 IDEXX試劑盒診斷相對(duì)敏感性和相對(duì)特異性結(jié)果

表3 VMRD試劑盒診斷相對(duì)敏感性和相對(duì)特異性結(jié)果

3.2 檢測(cè)低限試驗(yàn)

根據(jù)試劑盒檢測(cè)低限試驗(yàn)結(jié)果繪制折線圖，為了便于比較，IDEXX試劑盒S/P值用百分?jǐn)?shù)表示，結(jié)果見圖1。

圖1 3個(gè)試劑盒對(duì)4份陽性血清系列稀釋后檢測(cè)折線圖

結(jié)果顯示，對(duì)樣品1和樣品2，IDEXX試劑盒和VMRD試劑盒檢測(cè)靈敏度基本一致，較Svanova試劑盒檢測(cè)低限高1－2個(gè)滴度;對(duì)于樣品3，Svanova試劑盒檢出限最高，VMRD試劑盒最低，相差2個(gè)滴度;對(duì)于4號(hào)樣品，VMRD試劑盒與Svanova試劑盒檢出限一致，較INDEXX高1個(gè)滴度。從本次檢測(cè)4份樣品來看，難以比較哪個(gè)試劑盒具有更高的檢出限。

3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

選擇10份樣品進(jìn)行4次重復(fù)檢測(cè)，3個(gè)試劑盒變異系數(shù)均在10%以內(nèi)。

3.4 國內(nèi)外血清樣品檢測(cè)

3.4.1 3個(gè)試劑盒對(duì)不同國家樣品檢測(cè)結(jié)果

用3個(gè)試劑盒分別對(duì)采自澳大利亞、新西蘭、烏拉圭和中國新疆的牛血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表4。

結(jié)果表明，除VMRD和IDEXX 2個(gè)試劑盒對(duì)新疆46份血清檢測(cè)陽性率相同外，3個(gè)試劑盒對(duì)澳大利亞牛血清陽性檢出率較低，從0%至4.9%，對(duì)4個(gè)國家的牛血清平均陽性檢出率分別為6.7%(新西蘭)、2.4%(澳大利亞)、26.6%(烏拉圭)和25.3%(中國新疆)，不同試劑盒對(duì)同一國家樣品檢測(cè)陽性率差異極顯著。

同一地區(qū)不同試劑盒陽性檢出率同行比較，無相同小寫字母表示差異極其顯著(P＜0.01)。

表4 3個(gè)試劑盒對(duì)不同國家樣品檢測(cè)分類統(tǒng)計(jì)

3.4.2 試劑盒符合率檢測(cè)

對(duì)4個(gè)國家共157份樣品用3個(gè)試劑盒分別檢測(cè)，比較試劑盒之間的符合率，結(jié)果表明，Svanova與VMRD 2個(gè)試劑盒之間符合率為65.8% －95.1%，對(duì)烏拉圭樣品檢測(cè)的符合率較低，對(duì)澳大利亞樣品檢測(cè)符合率較高;Svanova與IDEXX 2個(gè)試劑盒之間符合率為70.7% －97.6%，對(duì)烏拉圭樣品檢測(cè)的符合率較低，對(duì)澳大利亞樣品檢測(cè)陽性符合率較高;IDEXX與VMRD 2個(gè)試劑盒對(duì)4個(gè)國家的樣品檢測(cè)符合率均較高，為90.0% －97.6%。見表5。

表5 3個(gè)試劑盒對(duì)不同地區(qū)樣品檢測(cè)符合率分類統(tǒng)計(jì)

不同試劑盒對(duì)同一地區(qū)血清用檢測(cè)符合率比較，不同大寫字母表示差異極顯著(P＜0.01)。

4 討論

由于各種商品化的ELISA檢測(cè)試劑盒質(zhì)量不一，并且因個(gè)體差異等原因，適用于一個(gè)國家或地區(qū)樣品的檢測(cè)試劑盒，不一定能夠適用于另個(gè)一國家樣品的檢測(cè)［4］。因此，實(shí)驗(yàn)室使用檢測(cè)試劑盒前，做好評(píng)估工作至關(guān)重要。敏感性和特異性是評(píng)估試劑盒的2個(gè)重要指標(biāo)，所選擇的參考動(dòng)物對(duì)所有宿主的代表程度和所檢測(cè)目標(biāo)動(dòng)物群的環(huán)境因子，對(duì)闡述試驗(yàn)結(jié)果有很大影響。本研究以澳大利亞、新西蘭、烏拉圭和中國的牛血清作為被檢對(duì)象，參考標(biāo)準(zhǔn)［5］對(duì)國內(nèi)常用的3種檢測(cè)新孢子蟲血清抗體試劑盒進(jìn)行了比較檢測(cè)，所選樣品具有一定的代表性。已有報(bào)道表明，上述3個(gè)試劑盒均具有較好的敏感性和特異性，可作為檢測(cè)新孢子蟲病的有效方法［6－8］。所以，本研究除對(duì)5份已知陽性血清和陰性血清外進(jìn)行檢測(cè)外，還以其中的2個(gè)試劑盒檢測(cè)均為陰性或陽性的血清定為真陰性或真陽性，用來對(duì)另一個(gè)試劑盒進(jìn)行評(píng)估，可進(jìn)一步增加結(jié)果的準(zhǔn)確性。

對(duì)4個(gè)國家共157份樣品用3個(gè)試劑盒分別檢測(cè)，比較試劑盒之間的符合率。結(jié)果表明，各個(gè)試劑盒對(duì)不同國家樣品檢測(cè)的符合率不同，IDEXX與VMRD 2個(gè)試劑盒檢測(cè)符合率較高;對(duì)不同國家的樣品而言，3個(gè)試劑盒對(duì)澳大利亞和新西蘭樣品檢測(cè)符合率較高，為90% －97.6%;對(duì)烏拉圭樣品檢測(cè)的符合率較低，為65.8% －94.1%。從3個(gè)試劑盒操作程序來看，IDEXX和VMRD操作時(shí)間較短，從樣品稀釋開始，整個(gè)檢測(cè)時(shí)間約2h，但VMRD采用cELISA，不需樣品稀釋，可以提高診斷的特異性和敏感性［5，9］。

用3個(gè)試劑盒對(duì)澳大利亞、新西蘭和烏拉圭2010年底至2011年初進(jìn)口牛血清進(jìn)行了新孢子蟲血清抗體檢測(cè)。雖然澳大利亞血清用Svanova試劑盒檢測(cè)為陰性，新西蘭血清用VMRD試劑盒檢測(cè)為陰性，但已有報(bào)道表明，澳大利亞和新西蘭都有新孢子蟲病的發(fā)生和流行［10，11］。3個(gè)試劑盒對(duì)所檢測(cè)的4個(gè)國家血清平均陽性檢出率分別為6.7%(新西蘭)、2.4%(澳大利亞)、26.6%(烏拉圭)和24.6%(中國新疆)，但不同試劑盒對(duì)同一國家樣品檢測(cè)陽性率差異極顯著。

注:本研究結(jié)果只針對(duì)本批試劑盒和所采集的樣品進(jìn)行了探索性的研究，結(jié)果不作為商業(yè)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

［1］De Oliveira V S，Alvarez－Garcia G，Ortega－Mora，et al.Abortions in bovines and Neospora caninum transmission in an embryo transfer center［J］.Vet Parasitol，2010，173(3 －4):206 －210.

［2］Reiterova K，Spilovska S，Antolova，et al.Neospora caninum，potential cause of abortions in dairy cows:the current serological follow － up in Slovakia［J］.Vet Parasitol，2009，159(1):1 － 6.

［3］張昌盛，劉群.奶牛新孢子蟲病血清流行病學(xué)調(diào)查［J］.中國獸醫(yī)雜志，2006，42(6):3－5.

［4］徐朝哲.進(jìn)出境動(dòng)物檢疫手冊(cè)(第一版)［M］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011:200－203.

［5］SN/T 2435－2010出入境動(dòng)物檢疫診斷試劑盒質(zhì)量評(píng)價(jià)規(guī)程［S］.

［6］Timothy V，Bruce A M.Validation of a commercially available monoclonal antibody－based competitive－inhibition enzymelinked immunosorbent assay for detection of serum antibodies to Neospora caninum in cattle［J］.J Clin Microbiol，2001，39(11):3851－3857.

［7］Williams D J L，Davison H C，Helmick B，et al.Evaluation of a commercial ELISA for detecting serum antibody to Neospora caninum in cattle［J］.Veterinary Record，1999，145(20):571－575.

［8］Jenny Frosslinga，Ann Lindberg，Camilla Bjorkman，et al.Evaluation of an iscom ELISA used for detection of antibodies to Neospora caninum in bulk milk［J］.Preventive Veterinary Medicine，2006，74(2 －3):120 －129.

［9］Juko U，Kazunori IKE，Tetsro K.Monclonal antibodies prevention invasion of Nespofa caninum tachyzoites in host cells［J］.J Vet Med Sci，2001，66(11):1355 －1358.

［10］Wouda W，Bartels C J M，Moen A R，et a1.Characteristics of Neospora caninum－associated abortion storms in dairy herds in the Netherlands(1995 to 1997)［J］.Theriogenology，1999，52(2):233－245.

［11］羅洪林，黃雛義，夏萌.新孢子病研究概況［J］.中國動(dòng)物檢疫，2004，21(12):42 －44.