微乳T(mén)LC應(yīng)用于療筋涂膜劑中分離鑒定的對(duì)比研究

李得堂， 張麗娟， 唐洪梅*， 蔡慶群， 丘振文， 廖小紅

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山醫(yī)院，廣東 中山 528400；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405）

療筋涂膜劑由我院院內(nèi)制劑改良研制開(kāi)發(fā)，由大黃、兩面針、黃芩、冰片、薄荷腦等中藥組成，具有活血祛瘀、消腫止痛的功效。主要用于外傷性疾病和風(fēng)濕性疾?。?-3］。常用有機(jī)溶劑為展開(kāi)劑的薄層色譜法在療筋涂膜劑黃芩的鑒別中出現(xiàn)斑點(diǎn)明顯的拖尾和擴(kuò)散，經(jīng)過(guò)多次變換展開(kāi)劑及比例、控制展開(kāi)溫濕度等均不能改善，引用微乳液為展開(kāi)劑的薄層色譜，通過(guò)對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，可以明顯改善常用展開(kāi)劑鑒別黃芩時(shí)斑點(diǎn)拖尾嚴(yán)重、擴(kuò)散的現(xiàn)象，分離效果及檢測(cè)靈敏度顯著提高，且斑點(diǎn)圓而集中，供試品清晰觀察的斑點(diǎn)數(shù)由傳統(tǒng)薄層色譜3個(gè)增加到9個(gè)，Rf值高的成分亦無(wú)擴(kuò)散現(xiàn)象。微乳液是由表面活性劑、助表面活性劑、油和水按適當(dāng)比例自發(fā)生成的無(wú)色透明、各向同性、低黏度的熱力學(xué)穩(wěn)定體系，與膠束體系皆屬締和膠體，但在基本特性上存在著明顯的差別。微乳體系與膠束體系相比，具有更大的增溶量(增溶量:膠束體系5% ～20%，微乳體系60% ～70%)和超低界面張力(界面張力:油水界面72，膠束體系20，微乳體系10－2～10－4)［4-5］。微乳體系的以上優(yōu)勢(shì)有利于提高色譜的效率。參考文獻(xiàn)［6-7］以含水量不同，具有油包水(W/O)型、雙連續(xù)型(W/O～O/W)及水包油(O/W)型的6種SDS-正丁醇-正庚烷-水微乳液為展開(kāi)劑，應(yīng)用于療筋涂膜劑中黃芩分離鑒定的研究發(fā)現(xiàn)，75%的微乳液為展開(kāi)劑可以改善常用展開(kāi)劑鑒別黃芩時(shí)斑點(diǎn)拖尾嚴(yán)重、擴(kuò)散的現(xiàn)象，通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化文獻(xiàn)微乳液的配比，分離效果及檢測(cè)靈敏度更顯著提高，此方法應(yīng)用于蘇木，兩面針等成分也得到較理想的效果。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 CAMAG薄層色譜系統(tǒng)(UV-LAMPEN，TLC Plate HeaterⅢ，Holder for Digital Camera for Reprostar 3)，點(diǎn)樣用定量毛細(xì)管(日本)；層析玻璃缸；超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；恒溫干燥箱(北京市朝陽(yáng)區(qū)來(lái)廣營(yíng)醫(yī)療器械廠)；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)；電子分析天平(SARTORIUS AG GOTTINGEN Germany BP211D)。

1.2 試藥 療筋涂膜劑(制劑室自制，091223，091225，091227)；硅膠G(青島海洋化工廠)；層析用聚酰胺薄膜(浙江省臺(tái)州市路橋四青生化塑料廠)；黃芩苷對(duì)照品、黃芩、蘇木、兩面針對(duì)照藥材(中國(guó)藥品生物制品檢定所)；十二烷基硫酸鈉(SDS)(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；正庚烷(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；正丁醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 微乳展開(kāi)劑的配制2.1.1文獻(xiàn)微乳展開(kāi)劑的配制［6-8］在保證SDS-正丁醇-正庚烷為0.27∶0.63∶0.10(質(zhì)量比)的條件下，改變水量，配制一系列微乳展開(kāi)劑。按上述質(zhì)量比取SDS、正丁醇、正庚烷，加適量水?dāng)嚢枞芙?，超? min，然后加水至足量，混勻，放置24 h即可。6種微乳液的成分配比及結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1。

表1 微乳展開(kāi)劑成分配比及結(jié)構(gòu)(總量100 g)

2.1.2 經(jīng)過(guò)改良優(yōu)化后微乳展開(kāi)劑的配制［9］優(yōu)化后SDS-正丁醇-正庚烷質(zhì)量比為0.39∶0.52∶0.09，配制方法同

2.1.1 項(xiàng)下。6種微乳液的成分配比及結(jié)構(gòu)見(jiàn)表2。選取文獻(xiàn)配制一系列微乳展開(kāi)劑，應(yīng)用于療筋涂膜劑中黃芩分離鑒定研究發(fā)現(xiàn)，W/O型微乳液(15% ～30%)為展開(kāi)劑，色譜中斑點(diǎn)不規(guī)則，分離效果極差，展開(kāi)速度較慢，兩個(gè)溶劑前沿均不平整，基本不能分離，以油水雙連續(xù)型微乳液(45% ～60%)為展開(kāi)劑，分離度等有所改善，但也常常不理想，也達(dá)不到預(yù)期效果，以O(shè)/W型微乳液(70% ～80%)為展開(kāi)劑，供試品中較多的組分達(dá)到分離，斑點(diǎn)規(guī)則集中，可以改善常用展開(kāi)劑分離鑒定黃芩時(shí)斑點(diǎn)拖尾嚴(yán)重、擴(kuò)散的現(xiàn)象，兩個(gè)溶劑前沿也不平整，展開(kāi)組分軌跡常跑偏，通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化文獻(xiàn)微乳液的配比對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，以O(shè)/W型微乳液(70% ～75%)為展開(kāi)劑，SDS-正丁醇-正庚烷質(zhì)量比為0.39∶0.52∶0.09，分離效果及檢測(cè)靈敏度更顯著提高，兩個(gè)溶劑前沿平整，組分軌跡平直。含水量75%微乳液為展開(kāi)劑較70%含水量微乳液分離效果好，而且多分離出2個(gè)斑點(diǎn)，最終選擇以改良后75%含水量O/W型微乳液為展開(kāi)劑用于黃芩、蘇木及兩面針等成分，分離效果及檢測(cè)靈敏度較高，得到較滿意的效果。

表2 微乳展開(kāi)劑成分配比及結(jié)構(gòu)(總量100 g)

2.2 常用展開(kāi)劑應(yīng)用于黃芩的鑒別 取本品4 g，加乙醚30 mL，超聲10 min，濾過(guò)，藥渣揮干乙醚，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5 mL使溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為1～2，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃芩苷對(duì)照品加甲醇制成每1 mL含1 mg的對(duì)照品溶液。再取缺黃芩的涂膜劑，同供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、陰性樣品溶液各4 μL以及對(duì)照品溶液1 μL，分別點(diǎn)于羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板和聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)為展開(kāi)劑，預(yù)飽和30 min，展開(kāi)，取出，晾干，噴2%三氯化鐵乙醇溶液，日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的暗綠色斑點(diǎn)，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，改變供試品制備方法，變換展開(kāi)劑及比例、控制展開(kāi)溫濕度等方法，黃芩苷斑點(diǎn)均拖尾和擴(kuò)散。薄層色譜結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 黃芩傳統(tǒng)薄層色譜圖

2.3 微乳液為展開(kāi)劑應(yīng)用于黃芩的分離鑒定 取黃芩對(duì)照藥材1 g，照2.2項(xiàng)下制備黃芩的對(duì)照藥材溶液，照薄層色譜法(附錄ⅥB)試驗(yàn)，取2.2項(xiàng)下供試品溶液、陰性樣品溶液、對(duì)照品及對(duì)照藥材溶液各1 μL，分別點(diǎn)于聚酰胺薄膜上，以75%的微乳液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視；黃芩苷為深藍(lán)色斑點(diǎn)，斑點(diǎn)圓而不拖尾不擴(kuò)散，供試品清晰觀察的斑點(diǎn)數(shù)為6個(gè)，Rf值高的成分亦無(wú)擴(kuò)散現(xiàn)象，陰性對(duì)照無(wú)干擾。噴2%三氯化鐵乙醇溶液，日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品及對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，均顯相同顏色的斑點(diǎn)，斑點(diǎn)圓且集中，此時(shí)黃芩苷為深綠色斑點(diǎn)，供試品清晰觀察的斑點(diǎn)數(shù)為9個(gè)，Rf值高的成分亦無(wú)擴(kuò)散現(xiàn)象，3批供試品與黃芩對(duì)照藥材溶液相同顏色位置有5個(gè)清晰的斑點(diǎn)。陰性樣品無(wú)干擾，本方法專(zhuān)屬性好，可以明顯改善常用展開(kāi)劑鑒別黃芩時(shí)斑點(diǎn)拖尾嚴(yán)重、擴(kuò)散的現(xiàn)象，分離效果及檢測(cè)靈敏度顯著提高，且斑點(diǎn)圓而集中，清晰觀察的斑點(diǎn)數(shù)較多，Rf值高的成分亦無(wú)擴(kuò)散現(xiàn)象，說(shuō)明微乳薄層色譜法可以簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效地分離和鑒定療筋涂膜劑中黃芩成分。薄層色譜結(jié)果見(jiàn)圖2(a.365 nm熒光下，b.日光下)

圖2 黃芩微乳薄層色譜圖

2.4 微乳液為展開(kāi)劑應(yīng)用于蘇木、兩面針的同時(shí)分離鑒定 以上述微乳液為展開(kāi)劑，將該法應(yīng)用于療筋涂膜劑中蘇木、兩面針同時(shí)分離鑒定。取供試品2 g，加乙醇10 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。另取蘇木、兩面針對(duì)照藥材各0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取缺蘇木、兩面針的涂膜劑，同供試品溶液制備法制備陰性樣品溶液。照薄層色譜法(附錄VI B)試驗(yàn)，吸取上述溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以75%的微乳液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與蘇木、兩面針對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陰性樣品無(wú)干擾，本法專(zhuān)屬性好。供試品與蘇木及兩面針在色譜中清晰可見(jiàn)各2個(gè)熒光斑點(diǎn)，斑點(diǎn)圓，無(wú)擴(kuò)散，分離效果及檢測(cè)靈敏度較好。結(jié)果見(jiàn)圖3。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)鑒于常用展開(kāi)劑薄層色譜法應(yīng)用于療筋涂膜劑中黃芩等鑒別的斑點(diǎn)拖尾，擴(kuò)散等現(xiàn)象，采用75%含水量O/W型微乳液為展開(kāi)劑的微乳薄層色譜法分離鑒定，與傳統(tǒng)薄層色譜法對(duì)比研究，可以明顯改善常用展開(kāi)劑鑒別黃芩時(shí)斑點(diǎn)拖尾嚴(yán)重、擴(kuò)散的現(xiàn)象，分離效果及檢測(cè)靈敏度顯著提高，且斑點(diǎn)圓而集中，供試品清晰觀察的斑點(diǎn)數(shù)增加到9個(gè)，Rf值高的成分亦無(wú)擴(kuò)散現(xiàn)象。

圖3 蘇木、兩面針微乳薄層色譜圖

通過(guò)對(duì)文獻(xiàn)微乳基本配比進(jìn)行改良，選取改良后微乳基本配比的不同含水量微乳液與文獻(xiàn)中配比為展開(kāi)劑對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，W/O型微乳液(15% ～30%)為展開(kāi)劑，色譜中斑點(diǎn)不規(guī)則，展開(kāi)速度極慢，分離效果較差，以油水雙連續(xù)型微乳液(45% ～60%)為展開(kāi)劑，分離度等有所改善，但常不理想；以O(shè)/W型微乳液(70% ～75%)為展開(kāi)劑，供試品中較多的組分達(dá)到完全分離，斑點(diǎn)規(guī)則集中，含水量75%微乳液為展開(kāi)劑較70%含水量微乳液分離效果好，而且多分離出2個(gè)斑點(diǎn)，最終選擇以改良后75%含水量O/W型微乳液為展開(kāi)劑，微乳液 SDS-正丁醇-正庚烷質(zhì)量比為 0.39 ∶0.52∶0.09，分離效果及檢測(cè)靈敏度較高，得到較滿意的效果。

微乳薄層色譜法展開(kāi)劑使用不同含水量的微乳液，主要成分為水，且用量少，揮發(fā)性較小，徹底替代甲苯、苯等毒性大、致癌、污染大的有機(jī)溶劑作為展開(kāi)劑；成本小、降低藥材及成品檢驗(yàn)的高成本；環(huán)保，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員身體損害?。晃⑷橐壕哂斜饶z束體系更大的增溶量和超低界面張力，更大提高色譜效率。微乳展開(kāi)系統(tǒng)的增溶、降低界面張力、靜電、疏水及立體效應(yīng)，使其具有獨(dú)特的選擇性，可同時(shí)分離親水物質(zhì)和疏水物質(zhì)，對(duì)帶電成分和非帶電成分亦有較好的分離選擇，適用于分離差別很小的物質(zhì)，色譜效率高。組分斑點(diǎn)不擴(kuò)散，不受溫度(室溫)、濕度的顯著影響、與常用展開(kāi)劑相比，微乳液使斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度得到肯定的增強(qiáng)，因而檢測(cè)的靈敏度得以顯著提高，供試品制備可以只采用甲醇提取，節(jié)省有機(jī)溶劑，省去了常用展開(kāi)劑薄層色譜法中的多極性溶劑提取分離、多次萃取等繁瑣的“萃取、清洗”等步驟，極大地節(jié)省了實(shí)驗(yàn)的時(shí)間和提高了實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性［10-11］。

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