川芎提取工藝的研究

馬建春，曾 佳，關(guān)石鳳，區(qū)通源

（廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院 藥學(xué)部，廣東 廣州 510080）

川芎系傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖，味辛、溫，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效［1］，其主要活性成分為川芎嗪和阿魏酸。研究證實(shí)阿魏酸具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗血小板凝集及抗菌消炎等功效。阿魏酸的提取多采用滲漉法和加熱回流法。超臨界CO2萃取法（SFE-CO2）具有效率高、操作溫度低、無溶劑殘留及產(chǎn)品易分離等優(yōu)點(diǎn)，越來越多地應(yīng)用于中藥脂溶性成分的提取。本文以提取物中阿魏酸的含量為指標(biāo)，考察了滲漉、加熱回流、SFE-CO2等方法川芎中阿魏酸的提取率，優(yōu)選其工藝條件，為工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Dionex ultimate 3000高效液相色譜儀、光電二極管陣列檢測(cè)器、Chromeleon色譜工作站（美國Dionex公司）；HA121-50-01超臨界流體萃取設(shè)備（江蘇科研儀器有限公司）；BS423S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ-100型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

阿魏酸對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110773-201012）；川芎藥材購自廣州致信藥業(yè)有限公司，經(jīng)鑒定為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖，測(cè)定阿魏酸含量為0.8%，符合《中國藥典》2010版一部川芎項(xiàng)下規(guī)定，粉碎成粗粉（過20目篩）備用；川芎提取物（廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院自制，批號(hào)101225）；甲醇為色譜醇，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品溶液制備

2.1.1 醇提法［2］

取川芎粗顆粒20g，加80%的乙醇8倍量，回流提取兩次，每次1.5h，提取液合并，濾過，濾液定容至500mL，作為樣品溶液Ⅰ。

2.1.2 超臨界CO2萃取法（SFE-CO2）［3］

取川芎粗顆粒300g放入萃取釜中，加入50%藥材量（mL·g-1）乙醇為夾帶劑，萃取壓力40.0MPa，萃取溫度50℃，解析壓力6MPa，解析溫度45℃，動(dòng)態(tài)萃取2h。收集提取物，定容至500mL，作為樣品溶液Ⅱ。

2.1.3 滲漉法［4］

取川芎粗顆粒20g，加95%乙醇浸泡48h，滲漉速度為15滴／min，滲漉時(shí)間為8h，滲漉液合并，濾過，濾液定容至500mL，作為樣品溶液Ⅲ。

2.2 阿魏酸含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取阿魏酸對(duì)照品10.56mg，加甲醇溶解并定容至10mL量瓶中；再精密吸1mL，甲醇稀釋并定容至50mL，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備

精密吸取樣品溶液Ⅰ、Ⅲ各1mL，分別置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)謩e用甲醇溶解并定容至10mL量瓶中，搖勻，作為供試品溶液Ⅰ、Ⅲ。

精密吸取樣品溶液Ⅱ1mL，用甲醇稀釋并定容至20mL量瓶中；再精密吸取1mL，甲醇稀釋并定容至10mL，搖勻，作為供試品溶液Ⅱ。

2.2.3 色譜條件

色譜柱為 Dikma C18（5μm，250mm×4.6mm）；流動(dòng)相為甲醇-1%冰醋酸（33：67）；檢測(cè)波長(zhǎng)為323nm；流速為1.0mL·min-1；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10μL。在此條件下，供試品阿魏酸與其他峰能達(dá)到基線分離，阿魏酸峰保留時(shí)間約為16min。

2.2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取上述對(duì)照品溶液3、5、10、15、20、30μL，注入液相色譜儀，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以阿魏酸μg數(shù)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y＝69.736X-0.1048，r＝0.9999。結(jié)果表明阿魏酸在0.0634～0.6336μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn)

取阿魏酸對(duì)照品溶液（0.021mg·mL-1），按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果，阿魏酸峰面積積分值的RSD＝1.32%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取阿魏酸對(duì)照品溶液（0.021mg·mL-1），按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件，于0、4、8、16、24h測(cè)定，結(jié)果，阿魏酸峰面積積分值的RSD＝1.05%（n＝6），表明對(duì)照品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好，能滿足測(cè)定要求。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)阿魏酸提取物（批號(hào)：101225），分別平行精密稱取6份，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果，提取物中阿魏酸的平均含量為8.32%，RSD＝0.86%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 回收率試驗(yàn)

精密稱取阿魏酸提取物（批號(hào)：101225，含量為8.32%），采用加樣回收試驗(yàn)法，按標(biāo)示量的80%、100%、120%，設(shè)計(jì)回收試驗(yàn)，共測(cè)定3組濃度9份樣品，結(jié)果阿魏酸的平均回收率98.21%，RSD＝1.12%（n＝6）。

2.2.9 樣品含量測(cè)定

按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定阿魏酸色譜峰峰面積積分值，計(jì)算阿魏酸的含量，并按下式計(jì)算阿魏酸的提取率：提取率（%）＝提取物中阿魏酸的質(zhì)量／藥材中阿魏酸的質(zhì)量×100%。結(jié)果見表1。

表1 不同提取方法阿魏酸含量比較

表1結(jié)果顯示，阿魏酸提取率以超臨界CO2萃取法＞滲漉法＞醇提法。采用超臨界CO2萃取法，提取物中阿魏酸含量可達(dá)到24.50%。綜合考慮，確定川芎采用超臨界CO2萃取法進(jìn)行提取。

2.3 提取工藝優(yōu)選

2.3.1 藥材粒度選擇

盡管超臨界CO2液體擴(kuò)散速度比一般液體快得多，但它跟一般的溶劑萃取有相同的特性，即原料粒度對(duì)傳質(zhì)效率有一定的影響。一般來說，粒度小時(shí)，CO2傳質(zhì)面積大，有利于液體CO2向物料內(nèi)部滲透，減少擴(kuò)散距離，提取效率較高；但若物料過細(xì)，在高壓下易被壓實(shí)而增加了傳質(zhì)阻力，從而使萃取效率下降。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，川芎細(xì)粉的超臨界CO2提取率僅為粗粉的70.32%，根據(jù)設(shè)備性能和藥材特點(diǎn)，確定藥材粒度為粗粉。

2.3.2 夾帶劑加入量選擇

夾帶劑確定為乙醇，加入方法為一步法［3］，分別加入藥材：乙醇（4：0、4：2、4：4、4：6、4：8）夾帶劑，固定萃取壓力40.0 MPa，萃取溫度50℃，解析壓力6MPa，解析溫度45℃，動(dòng)態(tài)萃取2h，收集提取物，測(cè)定阿魏酸的含量，計(jì)算提取率。結(jié)果見表2。

表2 夾帶劑用量對(duì)阿魏酸提取率的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，藥材：乙醇用量分別為4：6和4：8時(shí)，阿魏酸提取率幾無差異。因此，夾帶劑用量確定為藥材量的1.5倍。

2.3.3 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)

超臨界萃取流速一般采用固定值22L／h，解析溫度對(duì)結(jié)果影響較小，故采用均勻設(shè)計(jì)法對(duì)影響川芎中阿魏酸提取率的萃取壓力、萃取溫度、提取時(shí)間等因素進(jìn)行考察，優(yōu)選最佳工藝條件。按實(shí)驗(yàn)條件將3個(gè)因素等分為7個(gè)水平，因素水平見表3。按照U7（74）均勻設(shè)計(jì)安排試驗(yàn)，均勻設(shè)計(jì)結(jié)果見表4。

表3 因素水平

表4 川芎均勻?qū)嶒?yàn)結(jié)果

將表4中數(shù)據(jù)運(yùn)用均勻設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行二項(xiàng)多項(xiàng)式逐步回歸分析，得回歸方程：Y＝-12.4+8.65 X1-1.54 X2+9.82 X3-0.32+3.89 X1X3-1.08 X2X3。最高指標(biāo)時(shí)各個(gè)因素組合：X1＝1.2；X2＝9.98；X3＝105.6，顯著水平P＝0.005，統(tǒng)計(jì)量值F＝18.7，相關(guān)系數(shù)R＝0.962，調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)R＝0.9452，表明方程擬合度良好，因素顯著。用上述回歸方程作為目標(biāo)函數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果為：萃取壓力45MPa，萃取溫度55℃，提取時(shí)間3.5h。

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

取川芎粗粉300g，平行3份，裝入萃取罐中，按優(yōu)選工藝條件（即萃取壓力45MPa，萃取溫度55℃，解析壓力6MPa，解析溫度45℃，加入1.5倍藥材量乙醇）進(jìn)行提取，提取3.5h，收集提取物，測(cè)定阿魏酸的含量，計(jì)算出阿魏酸提取率為（92.21±0.15）%，證明優(yōu)選的工藝重現(xiàn)性好，合理，可行。

3 討論

（1）川芎中所含酚酸類成分專屬性較強(qiáng)，其中阿魏酸是川芎中具有代表性的活性成分。采用高效液相色譜法測(cè)定提取物中阿魏酸的含量，比較不同提取方法川芎中阿魏酸的提取率，結(jié)果顯示超臨界CO2萃取法阿魏酸提取率最高，且超臨界CO2萃取法萃取溫度低，防止阿魏酸的分解，故可適用于川芎中阿魏酸的提取。

（2）均勻設(shè)計(jì)是一種多因素與多水平試驗(yàn)的設(shè)計(jì)方法，具有“均勻分散，試驗(yàn)次數(shù)少”的特點(diǎn)，試驗(yàn)次數(shù)與水平數(shù)相等［5］，且試驗(yàn)結(jié)果可用計(jì)算機(jī)處理，通過回歸方程得出最佳實(shí)驗(yàn)條件。本研究采用均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)選阿魏酸超臨界CO2提取最佳工藝條件，主要考察了萃取壓力、萃取溫度、提取時(shí)間等主要影響因素。由于本試驗(yàn)無需二次分離，故固定解析壓力6MPa。

（3）由于超臨界CO2流體是極性小的溶劑，對(duì)親脂性物質(zhì)溶解度大，對(duì)極性大的阿魏酸溶解度較小，可在超臨界CO2流體中加入一定量的夾帶劑，可改變分子間的親和力，達(dá)到改變?nèi)軇┑臉O性、增加溶質(zhì)溶解度的目的，可大大提高提取效率［6］。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，常用的夾帶劑有甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等，但僅乙醇為無毒性溶劑，且對(duì)阿魏酸提取效率較高［3］，故采用乙醇為夾帶劑。

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：38.

［2］崔麗娟，劉玉明.正交試驗(yàn)法優(yōu)選川芎中阿魏酸的提取工藝［J］.齊魯藥事，2005，24（9）：560.

［3］孫永躍，李淑芬，宋慧婷，等.超臨界CO2萃取川芎中藥效成分研究［J］.化學(xué)工程，2006，34（3）：60-63.

［4］魏玉平，劉俊，王永富，等.川芎中活性成分的提取工藝建立與綜合評(píng)判［J］.中草藥，2005，36（1）：53-54.

［5］李儉紅，鐘麗萍，陳虎，等.用均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)選知母總皂苷的提取工藝［J］.中國藥房，1999，10（1）：15.

［6］王東成.中藥超臨界流體萃取的特點(diǎn)及影響因素［J］.機(jī)電信息，2005（4）：25-27.