長期運動對BALB/c小鼠恐懼記憶形成及海馬區(qū)CD47表達的影響

施 翔，李 亞

體育運動對人類記憶功能的影響機制很復(fù)雜，也是現(xiàn)在的研究熱點。近年研究發(fā)現(xiàn)，長期規(guī)律的運動能增強和保護大腦的功能；運動不僅能降低認知功能損傷、阿默海茨病和癡呆發(fā)病的風(fēng)險，還能促進認知功能，包括學(xué)習(xí)和記憶這種高級腦功能形式[1]。目前通過一系列的相關(guān)動物實驗研究表明：適宜運動訓(xùn)練能促進大鼠海馬內(nèi)鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ（camkⅡ）、突觸蛋白（SynapsinⅠ）和突觸后致密物蛋白質(zhì)95（PSD-95）的表達增強，有助于動物海馬等與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的腦區(qū)神經(jīng)元的增殖、存活和分化，促進突觸傳遞的長時程增強（LTP），提高實驗動物的空間記憶和被動逃避記憶能力[2-3]。CD47分子又稱整合素相關(guān)蛋白（Integrin-associated protein，IAP），最初是通過人體胎盤與整合素αⅤβ3共純化，以及從血小板與β3整合素共同免疫沉淀之后形成，廣泛地表達于各種血細胞（紅細胞、淋巴細胞、血小板、單核細胞和中性粒細胞）表面，以及胎盤、肝和腦組織中[4]。它是一種50KD的膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族的成員，其配體有整合素分子、信號調(diào)節(jié)蛋白（singalregulatingproteins，slRps）以及血小板凝血酶敏感蛋白（thrombospondin，TsP）[5]。CD47分子是通過與其配體相互作用而對機體發(fā)揮重要的調(diào)控作用。目前對CD47的研究主要集中在紅細胞溶血疾病的治療、對免疫調(diào)控作用的影響以及在卵巢癌治療中的靶點作用，關(guān)于CD47在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究報道甚少[6-8]。國外神經(jīng)生物學(xué)家通過蟲媒病毒（Sindbis virus）作為逆轉(zhuǎn)錄基因載體對大鼠進行了基因載體介導(dǎo)實驗研究，提出了CD47在大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的發(fā)育早期能明顯地有利于樹突的生長，其在促進大腦皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)育以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的整合上具有一定的積極作用[9]。

本研究旨在前人研究的基礎(chǔ)上，驗證長期中度跑步運動訓(xùn)練是否可以改善BALB/c小鼠學(xué)習(xí)記憶行為的表現(xiàn)，同時進一步分析其背后的生理生化機制是否牽涉CD47的表達，為研究運動對學(xué)習(xí)記憶促進作用的機理提供新的理論和實驗依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 實驗動物 本實驗采用11周齡的健康雄性BALB/c品系小鼠共40只，體重20～25 g，購買于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。動物飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)的塑膠鼠籠，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，給予充分的飼料及飲水。動物飼養(yǎng)室的溫度維持在23℃～26℃，濕度維持在60%，光照時間在7：00～19：00之間。

1.1.2 實驗材料 大小鼠跑步機購于美國HARVARD公司；BA-200小鼠避暗儀購于上海軟隆科技發(fā)展有限公司，產(chǎn)品型號為 BW-BTM703；分光光度計（Eppendorf Biophoto，USA）；腎上腺皮質(zhì)酮檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）購于英國IDS公司，貨號AC-14F1；考馬斯亮藍試劑盒購于南京建成生物公司；組織蛋白裂解液購于碧云天RIPA裂解液，產(chǎn)品編號為P0013B；凝膠成像系統(tǒng)（Kodak Image Station 4000R，USA）。

1.2 方 法

1.2.1 實驗方案 本研究利用跑步機使11周齡小鼠接受2、3、4周的長期中度運動訓(xùn)練。運動訓(xùn)練都在白天進行。當(dāng)小鼠11周大時，先進行熟悉適應(yīng)訓(xùn)練，跑步機轉(zhuǎn)速為9 m/min，每天10 min。5天之后把動物隨機分成運動訓(xùn)練組和對照組，2組按如下方案進行分配。

（1）運動訓(xùn)練組小鼠20只，在適應(yīng)訓(xùn)練后接受2、3、4周的運動訓(xùn)練，實驗組的運動訓(xùn)練強度參照謝康玲文章[10]的小鼠運動訓(xùn)練中的中強度運動訓(xùn)練方式進行設(shè)置。運動訓(xùn)練開始的第1周，跑步機的轉(zhuǎn)速設(shè)定為9 m/min，跑步20 min，每天逐漸遞增10 min，直到60 min為止；第2周開始轉(zhuǎn)速設(shè)定為9 m/min，每天運動60 min；第3～4周轉(zhuǎn)速設(shè)定為10 m/min，每天運動60 min。急性運動試驗，運動組將接受單次急性運動，跑步機的轉(zhuǎn)速為9 m/min，時長為60 min。

（2）對照組小鼠20只，在適應(yīng)訓(xùn)練后放在跑步機上10 min但不運動；在急性運動試驗中，同樣采取放在跑步機上10 min但不運動的方案。

（3）以上實驗方案進行2次重復(fù)，第1次重復(fù)，在小鼠訓(xùn)練運動結(jié)束后0 h和24 h 2個時間后對小鼠進行組織取樣，測定腎上腺皮質(zhì)酮濃度等相關(guān)指標(biāo)；第2次重復(fù)，通過小鼠避暗實驗觀察BALB/c小鼠恐懼記憶形成表現(xiàn)。

1.2.2 組織取樣 上述各組小鼠根據(jù)實驗方案，在預(yù)定的時間內(nèi)用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔麻醉后，眼眶取血處死小鼠后快速斷頭取腦。在預(yù)冷的0.01PBS取出雙側(cè)海馬組織和小腿比目魚肌，置于液氮速凍后，放置-80℃冰箱進行保存。血液在冰上靜置30 min后，在4℃下2 000 g離心30 min，收集上清放置-80℃冰箱進行保存。

1.3 相關(guān)指標(biāo)的測定

1.3.1 檸檬酸合酶活性的測定 將肌肉放置室溫5 min后加入裂解液（0.1M Tris buffer+0.1%Triton X-100）勻漿，在4℃下15 000 rmp離心15 min后，取上清到離心管，調(diào)整蛋白質(zhì)的濃度到1.5μg/μL，參照SRERE的方法測定檸檬酸合酶活性[11]。配置測定溶液（含有 0.1 mol/L Tris-HCl（Ph8.1），0.1 mmol/L 5-5'-二硝基苯，0.3 mmol/L乙酰輔酶A，0.5 mmol/L/草酰乙酸）。具體方法如下：將測定溶液990μL置于分光光度計中30℃預(yù)熱 3 min后加入10μL樣本（蛋白質(zhì)含量為1.5μg/μL），總體積為1 mL混勻后，5 s記錄412 nm處吸光度增加的速率。計算公式如下：樣本酶活性（IU）=（△A/min×T.V×106）/（ζ×1×S.V），其中△A/min為每分鐘吸光度的變化；TV為反應(yīng)系統(tǒng)總體積；SV為樣本體積；ζ為被測物（產(chǎn)物或底物）的摩爾吸光系數(shù)；ζ=16.595×103 mol/L，活力以nmol/min/mg蛋白表示。

1.3.2 腎上腺皮質(zhì)酮濃度的測定 該試劑盒應(yīng)用競爭性酶聯(lián)免疫分析法，采用抗腎上腺皮質(zhì)酮多克隆抗體包被于聚苯乙烯微孔板內(nèi)表層。標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和稀釋樣品與腎上腺皮質(zhì)酮標(biāo)記酶在微孔中一同孵育過夜（2℃～8℃），洗滌微孔后加入TMB，在405 nm波長處測量所有孔的吸光度。所有操作根據(jù)試劑盒說明書進行。大小鼠血清樣本中腎上腺皮質(zhì)酮的濃度參考范圍：23～363 ng/mL。

1.3.3 避暗實驗 實驗前將避暗潛伏期大于180 s的小鼠棄去不用。避暗儀暗室底部銅柵通36 v、50 Hz交流電，先將小鼠放入避暗儀反應(yīng)箱中訓(xùn)練3 min，小鼠受電擊逃往明室。正式測試開始時，將小鼠背對洞口放入明室，小鼠進入暗室則受到電擊，避暗儀自動記錄小鼠5 min內(nèi)首次進入暗室的時間，即為避暗潛伏期。第1天上午9：00開始訓(xùn)練實驗，次日上午9：00（訓(xùn)練實驗24 h后）進行測試，記錄5 min內(nèi)小鼠避暗潛伏期，即為BALB/c小鼠恐懼記憶形成的模型[12]。

1.3.4 CD47蛋白質(zhì)表達量的測定 稱取一定量的海馬組織，加入碧云天RIPA裂解液，在冰上勻漿，4℃12 000 g離心15 min后取上清，利用考馬斯亮藍試劑盒測定所提取總蛋白的濃度。將不同組別的小鼠海馬組織勻漿液上清定成相同的量后，加入1×上樣緩沖液在沸水中煮沸5 min。平衡各上樣孔的蛋白量后，按照每孔30μg，配置12%分離膠和5%的積層膠。積層膠采用70 mV電流電泳60 min；分離膠段采用100 mV電泳約120 min或待溴酚藍跑至分離膠底部上1 cm時終止電泳。將積層膠切去后，用濕轉(zhuǎn)法檢測總蛋白中CD47和β－actin的表達量。PVDF膜轉(zhuǎn)膜前用甲醇浸泡30 s，然后用轉(zhuǎn)移液浸泡5 min，采用200 mA電流轉(zhuǎn)膜90 min。轉(zhuǎn)膜完成后，用5%脫脂奶粉的封閉液4℃封閉過夜，室溫下封在封閉液中孵育CD47、β－actin蛋白一抗和羊抗小鼠IgG二抗各1 h。用TBST洗膜后通過ECL法進行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，Quantity One v4．6．2軟件對結(jié)果進行分析和比較。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS15．0統(tǒng)計軟件進行分析，所有的定量數(shù)據(jù)均先進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±sD）來表示。2組資料的比較采用獨立樣本T檢驗、皮質(zhì)酮和避暗實驗在組內(nèi)和不同組間的比較采用配對T檢驗和獨立樣本t檢驗。在不同組和不同時間點CD47變化用蛋白濃度灰度比值進行分析，采用兩因素析因設(shè)計資料的方差分析，其中P＜0．05。

2 實驗結(jié)果

2.1 長期中度跑步機運動后檸檬酸合成酶活性的變化

圖1 長期中度跑步機運動后檸檬酸合成酶活性的變化

在經(jīng)過4周中度運動訓(xùn)練之后，運動組的檸檬酸合成酶活性（0．201±0．018）大于對照組（0．170±0．017），且差異顯著（t=3．50，P=0．004）（見圖 1）。Figure 1 detecting the citrate synthase（CS）after long-term and moderate treadmill exercise training

2.2 長期中度跑步機運動后不同時間點腎上腺皮質(zhì)酮的濃度

表1結(jié)果顯示：4周最后一次運動后0 h，運動組腎上腺皮質(zhì)酮濃度為 86．69±18．07 ng/ml，大于對照組（44．17±7．29 ng/ml），且差異顯著（P＜0．05）；實驗后24 h，運動組的腎上腺皮質(zhì)酮濃度與0 h時相比，有顯著降低（P＜0．05），此時的濃度為 47．57±10．43 ng/ml，與對照組的（45．04±7．02 ng/ml）差異不顯著（P＞0．05）。

表1 長期中度跑步機運動后不同時間點的腎上腺皮質(zhì)酮濃度（ng/mL）Table 1 concentration of corticosterone at different time after long-term and moderate treadmill exercise training（ng/mL）

2.3 長期中度跑步機運動后小鼠恐懼學(xué)習(xí)能力的行為表現(xiàn)

表2結(jié)果顯示：經(jīng)過4周中度運動訓(xùn)練，運動組和對照組在PA測試中,訓(xùn)練期平均通過活門到達暗區(qū)的時間分別為11．1±3．6 s和 10．5±4．2 s，差異不顯著（P＞0．05）。在經(jīng)過 24 h 后開始的測試期中，之前暗區(qū)與被電擊所連結(jié)的恐懼記憶會反應(yīng)在亮區(qū)滯留的時間上，且待在亮區(qū)的滯留時間越長意味學(xué)習(xí)記憶能力越改善。結(jié)果顯示：對照組和運動組在測試中，測試期平均通過活門到達暗區(qū)的時間分別為 130．6±42．4 s 和 338．0±70．6 s，差異顯著（P＜0．05），運動組比對照組在小鼠恐懼學(xué)習(xí)能力上提高了1．72倍。

表2 長期中度跑步機運動后小鼠恐懼學(xué)習(xí)能力的行為表現(xiàn)Table 2 The learning and memory behavioralperformance of BALB/c mice after long-term and moderate treadmillexercise training

2.4 運動訓(xùn)練后不同時間點海馬回中CD47蛋白質(zhì)表現(xiàn)的變化

結(jié)果顯示：在最后一次運動后的0 h，在2、3和4周3個時間點運動組海馬回中CD47蛋白質(zhì)均較對照組表現(xiàn)上升，差異顯著（P＜0．05）。而在最后一次運動后的24 h，在第2周時，運動組海馬回中CD47蛋白質(zhì)已回落到對照組水平，與同期對照組比較差別不顯著（P＞0．05）；在第 3 周時，CD47蛋白質(zhì)雖有下降，與0 h比差別顯著（P＜0．05），但仍高于同期對照組水平，差別顯著（P＞0．05）；在第4周時，CD47蛋白質(zhì)雖略有下降，但與0 h比差別不顯著（P＞0．05），顯著高于同期對照組水平，差別顯著（P＞0．05）（見圖2）。

圖2 運動訓(xùn)練后不同時間點海馬回中CD47蛋白質(zhì)表現(xiàn)的變化Figure2 expression of CD47 in hippocampiafter the different time of exercise training

2.5 單次急性中度運動后海馬回中CD47蛋白質(zhì)表現(xiàn)的變化

為了探討2周中度運動訓(xùn)練后，所造成的大腦海馬回中CD47蛋白質(zhì)表現(xiàn)的增加，是否為急性運動的效果，而非運動訓(xùn)練的效果。本研究利用單次與運動訓(xùn)練同樣的運動強度、時間長度測量海馬回中CD47蛋白質(zhì)的表現(xiàn)。結(jié)果顯示：經(jīng)過急性運動后，運動組與對照組海馬回中CD47蛋白質(zhì)的表現(xiàn)沒有差異（P＞0．05），這表明單次急性運動不會造成海馬回中CD47蛋白質(zhì)的表現(xiàn)上升（見圖3）。

圖3 單次急性中度運動后海馬回中CD47蛋白質(zhì)表現(xiàn)的變化Figure 3 expression of CD47 in hippocampiin once acute exercise

3 分析與討論

3.1 長期中度跑步運動對小鼠學(xué)習(xí)記憶行為的影響

臨床研究和實驗室研究都證明了長期規(guī)律的運動能增強大腦的學(xué)習(xí)和記憶功能[13]。以往研究中，運動對學(xué)習(xí)記憶能力的影響主要機制在于腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurophic factor，BDNF）作用于海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)豐富表達的N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）及 α-氨基-3-羥-5-甲基-4-異惡唑丙酸（a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolep-propionate receptor，AMPAR）而引起信號通路激活[14]，從而引起大腦學(xué)習(xí)和記憶功能的增強，本研究豐富了這一學(xué)說。在本實驗中，長期跑步機運動訓(xùn)練可以提高BALB/c小鼠比目魚肌中檸檬酸合酶活性，證明本實驗的小鼠運動模型是成功的，通過長期跑步機運動訓(xùn)練能夠達到強化小鼠比目魚肌的訓(xùn)練效果。進一步，在經(jīng)過4周長期跑步機運動訓(xùn)練后，通過避暗實驗評價運動對小鼠記憶和學(xué)習(xí)能力的影響，主要表現(xiàn)在小鼠在亮區(qū)滯留的時間長短。結(jié)果表明：測試期運動組小鼠比對照組在恐懼學(xué)習(xí)能力上提高了1.72倍，即它在亮區(qū)滯留的時間越長。成功驗證了長期中度跑步運動的確能夠改善小鼠學(xué)習(xí)記憶行為的表現(xiàn)，這點也與其他研究結(jié)果類似[15]。

3.2 運動時間對BALB/c小鼠海馬回中CD47蛋白質(zhì)表達的影響

CD47最初是發(fā)現(xiàn)在人類胎盤和骨髓里的造血母細胞中[16]，在神經(jīng)系統(tǒng)中，CD47的功能主要是負責(zé)在發(fā)育以及神經(jīng)生長期間幫助細胞骨架重組[17]。CD47被視為一種細胞黏著的分子，提供了在細胞與細胞之間或是細胞與胞外間單獨執(zhí)行功能的受體可能性；CD47也是TSP（血小板反應(yīng)蛋白 Thrombospondin）的受體，已經(jīng)確定CD47在血管內(nèi)皮細胞的遷移、增殖、存活的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。而某些TSP-1能夠促進突觸的形成、激發(fā)神經(jīng)纖維的生長。有文獻指出，大鼠海馬區(qū)CD47基因的高表達與小鼠記憶形成有關(guān)系，然而這些研究僅僅停留在mRNA水平，通過對小鼠海馬區(qū)與記憶形成相關(guān)區(qū)域的研究，發(fā)現(xiàn)在這些區(qū)域中，細胞中CD47的信使RNA（Messenger RNA，Mrna）都是呈高水平表達的形式，CD47缺乏的小鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力較正常小鼠相比，相差甚遠[18]，但是，并沒有從蛋白水平給予最直接的證據(jù)[19]。也有實驗證實CD47-SIRPa（抑制性受體信號調(diào)節(jié)蛋白a）信號通路有利于神經(jīng)元細胞及其周邊分支的形成，并對神經(jīng)元的棘突與偽足的形成有著至關(guān)重要的作用，有利于生物記憶[20]。本實驗中，我們測得了第2、3、4周運動后0 h和24 h CD47蛋白表達的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組，即沒有接受任何訓(xùn)練的小鼠海馬區(qū)CD47的表達較為穩(wěn)定，維持在正常范圍內(nèi)；而接受訓(xùn)練后的小鼠CD47呈現(xiàn)高表達，說明運動的確可以誘導(dǎo)小鼠海馬區(qū)CD47的高表達。這種CD47的高表達是否能持續(xù)24 h呢，還是與運動累積的時間相關(guān)呢？在給予2周運動量的時間后，最后一次運動后24 h的CD47表達基本回落到對照組水平；在第3周，CD47的表達水平高于對照組卻低于結(jié)束訓(xùn)練時CD47的水平；而到第4周，CD47的高表達可以維持到24 h。說明這種CD47表達的時間持續(xù)性與運動時間累積的長短性具有顯著的相關(guān)性，而不是與運動量的累積相關(guān)。有文獻報道，跑步機運動訓(xùn)練對記憶的改善具有時間依賴性[21]，由此，我們可以推測小鼠運動時間越長，CD47表達越穩(wěn)定，小鼠學(xué)習(xí)記憶行為能力可能越強。

3.3 BALB/c小鼠海馬回中CD47蛋白質(zhì)表達的調(diào)控機制

在本研究中，4周長期跑步機運動訓(xùn)練后，小鼠血清中腎上腺皮質(zhì)酮水平升高。由于腎上腺皮質(zhì)酮參與機體對一切有害刺激的應(yīng)激反應(yīng)，小鼠運動后外源性刺激能夠誘導(dǎo)腎上腺皮質(zhì)酮水平升高符合實際情況。同時它對腦及腦垂體都具有反饋作用，從而可調(diào)整促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子和促腎上腺皮質(zhì)素的分泌。本試驗中，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)運動后的24 h，運動組的腎上腺皮質(zhì)酮濃度已恢復(fù)到正常水平，說明負反饋調(diào)節(jié)成功。有研究表明，運動對下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸）分泌有影響作用，同樣是通過應(yīng)激所產(chǎn)生的腎上腺糖皮質(zhì)激素作用與海馬中的糖皮質(zhì)激素受體而影響學(xué)習(xí)和記憶形成[22-23]。然而HPA軸分泌與CD47表達之間的關(guān)系并不清楚。

NRF-1為調(diào)控CD47的轉(zhuǎn)錄因子之一[24]，同時NRF-1也是其他與記憶學(xué)習(xí)相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄因子[25]，借由這條路徑亦可對CD47激活的信號通路做進一步解析。此外，絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase MAPK）的活化也需要CD47-介導(dǎo)神經(jīng)元的影響，MAPK信號通路是生物體內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)通路之一，MAPK信號通路通過此激酶的順次磷酸化，實現(xiàn)了細胞的外刺激信號向細胞核的轉(zhuǎn)移，在海馬依賴的學(xué)習(xí)、記憶功能以及長時間增強（LTP）和海馬結(jié)構(gòu)的重塑中發(fā)揮了重要的作用。

4 結(jié) 論

綜上所述，海馬區(qū)的CD47能改善小鼠的記憶能力，這將有助于解釋運動能幫助機體獲得與保持記憶的原因，也為運動對記憶損傷以及老年癡呆等醫(yī)療康復(fù)研究提供了一定的理論依據(jù)。同時，長期的體育運動能促使動物海馬區(qū)CD47穩(wěn)定表達的上升，且具有一定的運動時間依賴性，所以，人們在進行體育運動的同時，應(yīng)盡量安排合理的運動時間。

關(guān)于體育運動對大腦記憶能力的影響機制是非常復(fù)雜的，大腦記憶機制存在著許多未解之謎。本文涉及的長期運動對海馬區(qū)CD47的變化只是這個研究領(lǐng)域中的一小部分，希望不斷有新的研究能為解釋不同時間、不同強度以及不同種類的體育運動與神經(jīng)系統(tǒng)功能、學(xué)習(xí)記憶改善之間的關(guān)系提供更多的實驗依據(jù)，我們也將進行更深入的探討。

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