綠色木霉菌發(fā)酵液對(duì)芒果采后病害及品質(zhì)的影響

葉偉娟，馮衛(wèi)華，于 新,*，吳少輝，蔣 雨

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 成都 611130)

綠色木霉菌發(fā)酵液對(duì)芒果采后病害及品質(zhì)的影響

葉偉娟1，馮衛(wèi)華1，于 新1,*，吳少輝1，蔣 雨2

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 成都 611130)

研究木霉菌發(fā)酵液對(duì)控制芒果采后病害及腐爛的作用。以紫花芒果果實(shí)為材料，使用綠色木霉菌(Trichoderma viridePers.ex Fr.)發(fā)酵液涂抹果實(shí)，于(30±5)℃、相對(duì)濕度90%～95%貯藏，測(cè)定果實(shí)病斑數(shù)及面積、硬度和色澤指數(shù)。結(jié)果表明：紫花芒果貯藏至第9天，T. viride發(fā)酵液處理組腐爛指數(shù)僅為31.1%，對(duì)照組腐爛指數(shù)則達(dá)51.9%；損傷接種至7d時(shí)，T. viride發(fā)酵液處理組的病斑面積比對(duì)照組的小69.7%；貯藏至30d，T. viride發(fā)酵液處理的芒果自然發(fā)病率較清水處理組的低36.7%。T. viride發(fā)酵液處理組的芒果在貯藏6d后變軟，比對(duì)照組延緩了3d。T. viride發(fā)酵液混合CMC處理的果實(shí)轉(zhuǎn)黃速度較對(duì)照組延緩了3d。T. viride發(fā)酵液可顯著減低損傷接種芒果的腐爛指數(shù)、病斑面積和接種發(fā)病率。

綠色木霉菌；發(fā)酵液；芒果炭疽菌；病害；品質(zhì)

芒果(Mangifera indicaLinn)屬漆樹科植物，為熱帶地區(qū)廣為種植的一種呼吸躍變型水果。我國盛產(chǎn)芒果的地區(qū)主要有海南、廣東、廣西、云南、四川等地。炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioidesP. Henn)是芒果采后貯藏過程中影響最大的病原菌之一[1]，具有潛伏侵染特性[2-3]， 貯運(yùn)期間引起的芒果發(fā)病率可達(dá)30%～50%，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，多采用農(nóng)藥、殺菌劑、防腐劑等化學(xué)方法進(jìn)行芒果采后病害防治，但都存在一定食品隱患。因此，無毒、無污染、高效的天然果蔬保鮮劑的研究與開發(fā)越來越受到研究人員重視。

綠色木霉菌(Trichoderma viridePers.ex Fr.)能夠代謝產(chǎn)生多種具有抗生活性的物質(zhì)[4-6]，如水解酶類、多肽類、萜類、抗生類物質(zhì)等，在植物病害生防中起重要的作用[7-8]，但未見其發(fā)酵液用于防治果蔬采后病害。在前期體外研究T.viride發(fā)酵液對(duì)芒果炭疽菌抑制作用的基礎(chǔ)上[9]，本實(shí)驗(yàn)將T.viride發(fā)酵液應(yīng)用于芒果采后處理，研究其采后病害的防治效果及其對(duì)芒果貯藏品質(zhì)的影響，為探討以T.viride發(fā)酵液替代化學(xué)殺菌劑防治芒果采后病害提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫花芒(Mangifera indicaL. cv. Zihua)，2010年6月采于廣州市番禺區(qū)仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)場(chǎng)，選擇果實(shí)硬度均值大于15kg/cm2，果面為綠色，大小、成熟度一致的芒果進(jìn)行試驗(yàn)；T. viride廣東省微生物菌種保藏中心；C. gloeosporioides仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基優(yōu)化配方為質(zhì)量分?jǐn)?shù)77%水、20%土豆、2%葡萄糖、1%玉米粉、1‰聚山梨酯，pH9，培養(yǎng)基經(jīng)121℃滅菌30min，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004電子天平 德國Sartorial公司；PHS-25型酸度計(jì) 上海偉業(yè)儀器廠；DHZ-DA搖床 太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；SYQ-DSX-280B滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-IF型無菌超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；LRH-250A 型生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；R201D-II型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 無錫星海王生化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1T. viride發(fā)酵液制備

T. viride活化培養(yǎng)72h，加無菌水制成108CFU/mL菌懸液，備用。于250mL錐形瓶分別裝入50mL液體培養(yǎng)基、150μLT. viride菌懸液，置32.5℃、120r/min恒溫?fù)u床發(fā)酵7d。發(fā)酵完成后，過濾除去菌絲，轉(zhuǎn)入無菌離心管中4℃、6000r/min離心15min，取上清液，用0.22μm濾膜過濾。分別旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/2、1/4、1/8，置于4℃冷藏備用。

1.3.2 芒果接種發(fā)病率測(cè)定

將28℃培養(yǎng)10d的C. gloeosporioides用無菌水配制成孢子懸浮液。用血球計(jì)數(shù)板，將孢子濃度調(diào)至1× 106個(gè)孢子/mL，備用。芒果采收后，剔除病、傷果。選擇果實(shí)硬度均值大于15kg/cm2，果面為綠色、大小、成熟度一致的芒果。分別用70%酒精和無菌水擦拭果實(shí)表面進(jìn)行清潔，然后用注射器注射芒果炭疽菌孢子懸浮液，每果接種5個(gè)[10]。

用無菌棉蘸T. viride發(fā)酵液覆蓋接種點(diǎn)1min，共3次，然后自然晾干。以無菌水處理的芒果為對(duì)照。每組處理50個(gè)芒果，重復(fù)3次，室溫(30±5)℃、90%～95%相對(duì)濕度(relative humidity，RH)條件貯藏。每天觀察芒果發(fā)病率，利用十字交叉法測(cè)量病斑直徑(d)。分別取芒果病斑外2cm周圍的果肉和遠(yuǎn)離病斑的健康組織果肉待測(cè)各指標(biāo)。

1.3.3 芒果自然發(fā)病率測(cè)定

CMC黏度高、延展性強(qiáng)，有利于T. viride濃縮發(fā)酵液均勻地粘附在芒果表面，本實(shí)驗(yàn)添加CMC作為成膜劑。用清水清洗芒果，晾干分為3組，每組50只。采用浸涂法處理，分別用 0.05g/mL CMC溶液、含10% (V/V)T. viride濃縮發(fā)酵液的羧甲基纖維素(CMC)溶液(質(zhì)量濃度0.05g/mL)進(jìn)行浸涂處理，另一組不處理為對(duì)照組。貯藏過程中記錄發(fā)病及病斑情況，自然發(fā)病率計(jì)算公式如下[12]：

結(jié)合本實(shí)驗(yàn)芒果大小及接種的點(diǎn)數(shù)等因素綜合進(jìn)行分級(jí)[13]：0級(jí)：未發(fā)病；1級(jí)：病斑面積＜2cm2；2級(jí)：病斑面積＜8cm2；3級(jí)：病斑面積＜14cm2；4級(jí)：病斑面積＞14cm2。

1.3.4T. viride發(fā)酵液濃度對(duì)芒果果實(shí)腐爛面積的影響

80只芒果清洗后分4組進(jìn)行損傷接種，分別用濃縮倍數(shù)為2、4、8倍的T. viride發(fā)酵液處理，以無菌水處理為對(duì)照組，每天觀察病斑大小。

1.3.5 芒果果實(shí)硬度測(cè)定

圍繞果實(shí)腰部，各取4個(gè)點(diǎn)，削去果皮，用GY-1型硬度計(jì)測(cè)定果實(shí)硬度[14]。每個(gè)處理每次測(cè)定3個(gè)果實(shí)，重復(fù)3次。

1.3.6 芒果色澤指數(shù)測(cè)定

觀察每個(gè)處理的芒果果實(shí)果皮色澤變化。果皮顏色評(píng)價(jià)的色澤分為：0級(jí)：全綠；1級(jí)：果蒂轉(zhuǎn)黃；2級(jí)：果面＜25%轉(zhuǎn)黃；3級(jí)：果面25%～50%轉(zhuǎn)黃；4級(jí)：果面50%～75%轉(zhuǎn)黃；5級(jí)：全部轉(zhuǎn)黃[15-16]。色澤指數(shù)計(jì)算公式如下：

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

Excel 2003統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，每項(xiàng)個(gè)測(cè)定均重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。應(yīng)用SPSS 10.0軟件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并利用鄧肯氏(Duncan)多重比較進(jìn)行差異顯著性分析。P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1T. viride發(fā)酵液對(duì)芒果果實(shí)腐爛及病斑面積的影響

接種芒果炭疽菌后，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，芒果果實(shí)開始發(fā)病，并且病斑面積不斷擴(kuò)大，如圖1A所示。與對(duì)照相比，用T.viride發(fā)酵液處理的芒果感染C.gloeosporioides的腐爛指數(shù)(圖1B)和病斑面積同期較小。在前6d，腐爛情況都較輕，腐爛指數(shù)均小于10%。到第7天，對(duì)照組腐爛指數(shù)陡然增加，至26.1%，處理組僅為10.3%。第9天，對(duì)照組腐爛指數(shù)達(dá)51.9%，處理組腐爛指數(shù)僅為31.1%。

圖1 不同處理的芒果在貯藏過程中的病斑發(fā)展(A)和腐爛(B)情況Fig.1 Disease spot and decay status of mango fruits with different treatments during storage

2.2T. viride發(fā)酵液對(duì)接種發(fā)病率和自然發(fā)病率的影響

圖2 T.viride發(fā)酵液和CMC處理對(duì)芒果采后發(fā)病率的影響Fig.2 Effect of individual and combined fermentation broth and CMC on the incidence rate of diseases in post-harvest mango fruits

在實(shí)驗(yàn)條件下，清水和CMC處理組芒果的發(fā)病率無明顯差異。說明CMC對(duì)C. gloeosporioides不具有抑制作用。3個(gè)處理組的芒果自然發(fā)病率均隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而增加，T. viride發(fā)酵液處理組的芒果自然發(fā)病率均低于其他處理組同期的發(fā)病率(圖2)。貯藏至30d，T. viride發(fā)酵液處理組芒果發(fā)病率較清水處理組低36.7%。

接種處理后6d內(nèi)，T. viride發(fā)酵液處理組接種發(fā)病率都維持在較低水平，對(duì)照組在第6天已出現(xiàn)發(fā)病高峰，說明T.viride發(fā)酵液有效延遲了芒果果實(shí)接種發(fā)病高峰。芒果果實(shí)接種處理至6d，T.viride發(fā)酵液處理顯著降低了芒果果實(shí)接種發(fā)病率，僅為26.2%，對(duì)照組接種發(fā)病率已達(dá)76.4%。7d后，T.viride發(fā)酵液處理組與對(duì)照組間的差異逐漸縮??；第9天，兩組芒果果實(shí)的接種發(fā)病率均超過98%(圖3)。

圖3 接種炭疽菌芒果的貯藏發(fā)病情況Fig.3 Effect of fermentation broth of Trichoderma viride on the disease incidence rate of mango fruits inoculated with Colletotrichum gloeosporioides during storage

2.3T.viride發(fā)酵液濃度對(duì)芒果果實(shí)發(fā)病情況的影響

圖4 不同濃度T.viride發(fā)酵液處理芒果在貯藏期間的腐爛情況Fig.4 Effect of concentrated fermentation broth of Trichoderma viride on the decay index of mango fruits during storage

在相同貯藏時(shí)間內(nèi)，隨著T.viride發(fā)酵液濃度增加，芒果腐爛面積越小，且T. viride發(fā)酵液處理組芒果腐爛面積始終小于對(duì)照組(圖4)。貯藏至6d，濃縮8、4、2倍的T. viride發(fā)酵液處理組芒果病斑面積分別為4.4、9.8、14.5cm2，均小于對(duì)照組(19.9cm2)。濃縮2、4、8倍的T. viride發(fā)酵液處理的芒果分別推遲1、2、2.5d，才達(dá)到對(duì)照組同等腐爛面積。

2.4T. viride發(fā)酵液對(duì)芒果果實(shí)硬度的影響

芒果采后隨著貯藏期的延長(zhǎng)，果實(shí)硬度減小。T.viride發(fā)酵液處理組和對(duì)照組的變化趨勢(shì)相同，但硬度下降幅度不同(表1)。貯藏至第3天，對(duì)照組果實(shí)硬度急劇下降，由(10.76±0.45)kg/cm2驟降至(2.98± 0.31)kg/cm2(5d)；第6天，T.viride發(fā)酵液處理組的芒果硬度才出現(xiàn)急劇下降。第6天后，兩處理組的果實(shí)均后熟軟化，硬度差異不顯著，維持在2.86～2.65kg/cm2范圍內(nèi)。

2.5T. viride發(fā)酵液對(duì)芒果色澤轉(zhuǎn)化情況的影響

在貯藏過程中，T. viride發(fā)酵液混合CMC處理的芒果果實(shí)轉(zhuǎn)黃較遲。貯藏至6d，該組果實(shí)的轉(zhuǎn)黃率才有明顯提高，達(dá)60.3%，其他兩組的轉(zhuǎn)黃率在第3天已達(dá)60%。僅用CMC處理的芒果果實(shí)速度較快，轉(zhuǎn)黃率高于對(duì)照組果實(shí)，第9天時(shí)，色澤指數(shù)達(dá)85.2%，對(duì)照組僅為69.3%。貯藏至第9天，T. viride發(fā)酵液混合CMC處理組的色澤指數(shù)超過了對(duì)照組(圖5)。

表1 貯藏過程中芒果硬度變化Table 1 Hardness change of mango fruits receiving and not receiving treatment with fermentation broth of Trichoderma viride during storage kg/cm2

圖5 貯藏期間不同處理的芒果色澤變化Fig.5 Color change of mango fruits receiving and not receiving treatment with fermentation broth of Trichoderma viride during storage

3 討論與結(jié)論

T.viride發(fā)酵液可顯著減低損傷接種芒果的腐爛指數(shù)、病斑面積和接種發(fā)病率。貯藏至第9天，對(duì)照組的腐爛指數(shù)達(dá)51.9%，T.viride發(fā)酵液處理組腐爛指數(shù)為31.1%；損傷接種至7d時(shí)，T.viride發(fā)酵液處理組的病斑面積比對(duì)照組小69.7%；貯藏至30d，T.viride發(fā)酵液處理組自然發(fā)病率較對(duì)照組低36.7%。損傷接種7d后，T.viride發(fā)酵液處理組與對(duì)照組間的接種發(fā)病率差異逐漸縮小，第9天，兩組芒果果實(shí)的接種發(fā)病率均超過98%，這是果實(shí)后熟及衰老的結(jié)果。結(jié)合前期的體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這可能是T.viride發(fā)酵液中抗生物質(zhì)對(duì)C.gloeosporioides的抑制作用，從而延緩了芒果的腐爛。關(guān)于T.viride發(fā)酵液中抗生物質(zhì)組成，尚在進(jìn)一步研究之中。

芒果是典型的呼吸躍變型果實(shí)，不耐貯藏。芒果采后隨著貯藏期的延長(zhǎng)，果實(shí)轉(zhuǎn)黃，硬度下降。在室溫(30±5)℃貯藏期間，T.viride發(fā)酵液處理組和對(duì)照組的硬度均不斷下降，但T.viride發(fā)酵液處理組的芒果在貯藏5d后變軟，比對(duì)照組推遲了2d。兩處理組的芒果成熟軟化后的硬度差異不顯著，均維持在2.86～2.65kg/cm2范圍內(nèi)。果實(shí)后熟期間葉綠素降解，同時(shí)胡蘿卜素等色素積累，果實(shí)由綠轉(zhuǎn)黃。在貯藏過程中，3組芒果的顏色均逐漸由綠色轉(zhuǎn)為黃色，色澤指數(shù)不斷升高。不同處理組的轉(zhuǎn)黃速度不同，T.viride發(fā)酵液混合CMC組＜對(duì)照組＜CMC組。

總而言之，T.viride發(fā)酵液處理能顯著抑制芒果炭疽病的發(fā)生，減輕芒果采后病害，并延緩芒果的后熟生理作用，有利于芒果的貯藏、運(yùn)輸。這可能是因?yàn)門.viride發(fā)酵液處理后，抑制了芒果的呼吸作用，延遲了呼吸高峰的到來。黃雪蓮[17]采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)T.viride發(fā)酵液的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，主要是(E,E)-2,4-己二烯醛、3-吡啶酚、甲基-(5-羥基-1H-2-苯并咪唑)氨基甲酸酯、柏木醇、δ-芹子烯、間氟芐胺、2,3-二氫-4H-1-苯并噻喃-4-酮、9-芴酮等。其抗生物質(zhì)的抑制機(jī)理可能有兩方面：1)抗生物質(zhì)能夠通過病原真菌的細(xì)胞膜，并改變真菌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，破壞其細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能，引起細(xì)胞內(nèi)容物流出導(dǎo)致真菌死亡；2)抗生物質(zhì)通過抑制真菌的DNA、蛋白質(zhì)的合成或RNA的轉(zhuǎn)錄而表現(xiàn)抑菌效應(yīng)。關(guān)于T.viride發(fā)酵液誘導(dǎo)芒果采后抗病性的機(jī)制，還有待下一步研究，以期對(duì)T.viride發(fā)酵液處理對(duì)芒果采后病害的防治機(jī)理更深入了解。

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Effect of Fermentation Broth ofTrichoderma virideon Postharvest Diseases and Quality of Mango Fruits

YE Wei-juan1，F(xiàn)ENG Wei-hua1，YU Xin1,*，WU Shao-hui1，JIANG Yu2
(1. College of Light Industry and Food Science, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China；2. College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China)

In order to control post-harvest diseases of mango, mango fruits (Mangifera indicaL. var Zihua) were coated with fermentation broth ofTrichoderma virideand stored under the conditions of 90%－95% humidity and (30 ± 5) ℃. Disease spot number, hardness and color index were determined during the storage of mango fruits. On the 9th day, the decay index of mango fruits from the control group was as high as 51.9%, while that of mango fruits coated with fermentation broth ofT. viridewas only 31.1%. On the 7th day after inoculation ofColletotrichum gloeosporioidesP. Henn, disease spot area in the coating group was 69.7%, which was much lower than that in the control group. On the 30th day during the storage, natural incidence rate of diseases in mango fruits coated with fermentation broth ofT. viridewas 36.7%, which was also lower than that in the blank control. The mango fruits treated with fermentation broth ofT. viridewere soften after 6-day storage and revealed an extension of shelflife by 3 days when compared with the control. Combined treatment with fermentation broth ofT. virideand CMC could result in a delay for turning yellow of mango fruits by 3 days. Therefore, fermentation broth ofT. viridecoating can significantly decrease decay index, disease spot area and the incidence rate of diseases in mango fruits.

Trichoderma viride；fermentation broth；Colletotrichum gloeosporioidesP. Henn；disease；quality

S667.7

A

1002-6630(2012)18-0265-05

2011-08-05

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30871765)

葉偉娟(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程。E-mail：yeweijuan0301@126.com

*通信作者：于新(1959—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：yuxin1959@yahoo.com.cn