固相萃取-高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中的苯巴比妥

戴曉欣，朱新平*，吳仕輝，尹 怡，馬麗莎，陳昆慈，鄭光明，潘德博

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510380)

固相萃取-高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中的苯巴比妥

戴曉欣，朱新平*，吳仕輝，尹 怡，馬麗莎，陳昆慈，鄭光明，潘德博

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510380)

建立水產(chǎn)品中苯巴比妥殘留量測定的固相萃取-高效液相色譜方法。樣品經(jīng)乙酸乙酯提取，正己烷脫脂，通過C18固相萃取小柱富集和凈化，高效液相色譜儀進(jìn)行檢測。苯巴比妥在0.05～4.0μg/mL內(nèi)線性范圍良好，相關(guān)系數(shù)為0.9999。當(dāng)添加量在30～200μg/kg時(shí)，加標(biāo)回收率在80.49%～102.42%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.52%～10.15%，方法檢出限10μg/kg，定量限30μg/kg。研究結(jié)果表明本方法操作簡單、準(zhǔn)確度高，能滿足水產(chǎn)品中苯巴比妥殘留量的測定及確證工作的需要。

固相萃取；高效液相色譜；水產(chǎn)品；苯巴比妥；C18柱

苯巴比妥(phenobarbital)，化學(xué)名稱：5-乙基-5-苯基-2,4,6,(1H,3H,5H)-嘧啶三酮，屬于巴比妥類安眠鎮(zhèn)靜藥物，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的、心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)有明顯的抑制作用，過量可麻痹延髓呼吸中樞致死和導(dǎo)致人體出現(xiàn)過敏性反應(yīng)[1-2]。有研究認(rèn)為苯巴比妥存在致畸、致癌的毒副作用，現(xiàn)今世界各國均嚴(yán)禁用于食品動物[3-5]。在我國苯巴比妥被用于水產(chǎn)品運(yùn)輸中，被用作促生長飼料添加劑和屠宰時(shí)的化學(xué)保定劑，獸藥臨床用作鎮(zhèn)靜劑，可減少動物營養(yǎng)消耗，有益于增重[6-8]。我國農(nóng)業(yè)部176號公告已經(jīng)禁止在飼料和動物飲用水中使用。然而，仍有非法使用的情況。巴比妥類藥物長期使用具有累積作用，使用不當(dāng)會使動物體內(nèi)藥物蓄積濃度過高而影響食用者的安全，所以對其殘留量進(jìn)行檢測是必要的。

目前對苯巴比妥在藥物和血清中的濃度檢測的研究較多[9-14]，可食性動物組織中苯巴比妥的殘留檢測方法報(bào)道較少，常用的檢測方法包括高效毛細(xì)管電泳法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫吸附測定法[7,9-16]。趙海香等[17]用氣相-質(zhì)譜儀對苯巴比妥在豬肉中的殘留進(jìn)行過檢測，而水產(chǎn)品中苯巴比妥殘留量的檢測未見有報(bào)道。在這些方法當(dāng)中從分析的準(zhǔn)確性和操作的普及性來看的話，氣相色譜法和液相色譜法是比較適合的；和液相色譜法比較，氣相色譜法要對苯巴比妥進(jìn)行衍生化后才可以上機(jī)進(jìn)行分析，衍生化過程受溫度、反應(yīng)時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件影響較大，操作較復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)成本較高。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用固相萃取技術(shù)進(jìn)行前處理的優(yōu)化，通過高效液相色譜進(jìn)行檢測，擬建立適用于水產(chǎn)品中苯巴比妥殘留量的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚、南美白對蝦、甲魚和鰻鱺 廣州市購。

苯巴比妥對照品 中國藥品生物制品檢定所；乙酸乙酯和正己烷均為分析純試劑；乙腈(色譜純) 美國Sigma公司；C18固相萃取柱(500mg/3mL) 美國Supelco公司；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

1200型高效液相色譜儀(配紫外檢測器) 美國Agilent公司；均質(zhì)機(jī) 德國IKA公司；TGL-10B型離心機(jī) 上海安亭科技儀器廠；XW-80A型旋渦混合器 海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；RE201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州合眾儀器有限公司；AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈-水(40:60，V/V)；流速：0.9mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：220nm；進(jìn)樣量：20μL。

1.3.2 提取

準(zhǔn)確稱取5.00g勻漿處理好的肉糜樣品于50mL具塞塑料離心管中，加入5mL水，旋渦振蕩5min，加入15mL乙酸乙酯，旋渦振蕩提取10min，4500r/min離心5min，取上清液于100mL雞心瓶中。重復(fù)再用15mL乙酸乙酯振蕩提取一次，4500r/min離心5min，合并上清液到雞心瓶中。在40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。

1.3.3 凈化

加5.0mL體積分?jǐn)?shù)為10%的乙腈溶液溶解1.3.2節(jié)樣品，再加入10mL正己烷，旋渦混合1min，靜置10min，棄去正己烷層，再加入5mL正己烷重復(fù)上述操作一次，乙腈溶液留待過柱備用。

C18柱依次用3mL二氯甲烷、6mL甲醇和6mL水淋洗活化C18柱。轉(zhuǎn)移5mL備用液到柱上，依次用6mL水和6mL體積分?jǐn)?shù)為10%的乙腈溶液淋洗C18小柱，C18小柱用氮?dú)獯蹈伞Ｔ诓怀檎婵盏那闆r下用8mL二氯甲烷洗脫，收集洗脫液，于40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。

1.3.4 樣品測定

將1.3.3節(jié)所得樣品用流動相定容至1.0mL，經(jīng)0.45μm有機(jī)微孔濾膜過濾后供液相色譜分析，將20μL苯巴比妥系列標(biāo)準(zhǔn)工作液及樣品液分別注入于液相色譜儀中，按上述色譜條件進(jìn)行色譜分析，記錄峰面積，響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。

實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照：除不加試樣外，均按上述測定步驟進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 波長和流動相的確定

利用液相色譜的停泵掃描功能在200～400nm段進(jìn)行紫外掃描，最大吸收點(diǎn)在220nm附近，因此選定220nm為檢測波長。

分別以甲醇-乙腈-水(13:25:62，V/V)和乙腈-水(40:60，V/V)作流動相進(jìn)行檢測；比較兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)用乙腈溶解標(biāo)準(zhǔn)品及用乙腈作流動相進(jìn)行檢測時(shí)，峰形好，響應(yīng)值較高，而且在這個(gè)條件下也能夠得到良好的分離。故本實(shí)驗(yàn)采用乙腈溶解標(biāo)準(zhǔn)品并用乙腈-水(40:60，V/V)做流動相，在選定色譜條件下苯巴比妥的保留時(shí)間為6.0min左右。

2.2 提取劑的選擇

選用乙酸乙酯、乙腈和甲醇提取樣品中的苯巴比妥，對效果進(jìn)行比較，結(jié)果見表1。由于魚肉的含水量較高，用乙腈和甲醇提取時(shí)，會將大量的水和水溶性雜質(zhì)提取出來，后面旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時(shí)間長，測定時(shí)有干擾，而用乙酸乙酯作提取溶劑，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時(shí)間減少近一半，經(jīng)過比較，乙酸乙酯更適合作為提取劑。

表1 提取溶劑對草魚中添加苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)液回收的影響Table 1 Effect of solvent type on recovery rate of phenobarbital

2.3 凈化條件的確立

文獻(xiàn)中一般采取有機(jī)溶劑凈化[11-13]和固相萃取[17-18]凈化，本實(shí)驗(yàn)采用兩者結(jié)合的凈化方法。由于水產(chǎn)品中含有較高的脂肪，不把脂肪等雜質(zhì)去掉，會影響后續(xù)分析和凈化效果。實(shí)驗(yàn)用正己烷進(jìn)行脫脂凈化。為了避免脫脂時(shí)有可能出現(xiàn)的乳化現(xiàn)象而影響到回收，通過比較，正己烷的第一次的量為10mL，第二次的量為5mL可以達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需要的凈化效果。

由于巴比妥類藥物極性較弱，這里使用C18固相萃取小柱。根據(jù)苯巴比妥的性質(zhì)，分別選取體積分?jǐn)?shù)為30%，20%和10%的乙腈溶液作為上樣液。以標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)為30%和20%的時(shí)候，苯巴比妥無法完全被保留在C18萃取柱上，結(jié)果表明，10%的乙腈溶液能充分溶解蒸干后的樣品，而且目標(biāo)物可以被保留在C18萃取柱子上。

加標(biāo)的樣品經(jīng)過提取過柱凈化后，實(shí)驗(yàn)選用乙腈、甲醇、乙酸乙酯、正己烷:乙酸乙酯(7:3)混合液、叔丁基甲基醚和二氯甲烷作為洗脫劑并進(jìn)行比較，結(jié)果表明，而用二氯甲烷作為洗脫劑，苯巴比妥的色譜峰形尖銳性好，可以達(dá)到基質(zhì)干擾物分離的目的，而其他幾種的洗脫劑在把目標(biāo)物洗脫下來的同時(shí)，把雜質(zhì)也洗下來了，有明顯的干擾。乙酸乙酯、叔丁基甲基醚和二氯甲烷做洗脫劑時(shí)得到的結(jié)果的色譜圖見圖1。

圖1 3種不同洗脫劑的加標(biāo)樣品液相色譜圖Fig.1 Chromatograms of spiked samples eluted with ethyl acetate, methyl tert-butyl ether or dichlormethane

質(zhì)量濃度0.50μg/mL苯巴比妥的標(biāo)準(zhǔn)、草魚樣品(陰性樣品)和草魚樣品中添加100μg/kg苯巴比妥加標(biāo)樣品的色譜圖見圖2，與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比較可以看出樣品經(jīng)過處理后，凈化效果理想，目標(biāo)物和基質(zhì)干擾物達(dá)到了良好的分離而沒有影響分析。

圖2 苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.50μg/mL)(a)、陰性樣品(b)和加標(biāo)樣品(100μg/kg)(c)色譜圖Fig.2 Chromatograms of standard sample (a), blank sample (b) and spiked sample (c)

2.4 線性范圍

準(zhǔn)確稱取經(jīng)105℃干燥2h至質(zhì)量恒定的苯巴比妥用乙腈溶解并定容，保存于2～8℃冰箱中。準(zhǔn)確量取分別以0.05、0.10、0.20、0.60、1.00、2.00、4.00μg/mL苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，再用流動相稀釋成一系列濃度的工作液，以HPLC測得的峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，經(jīng)過擬合，得出線性方程：y＝42.76x＋0.9038，R2＝0.9999，結(jié)果表明在0.05～4.0μg/mL范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系。

2.5 回收率、精密度和檢測限

在草魚、南美白對蝦、甲魚和鰻鱺陰性肌肉組織樣品中分別添加3個(gè)添加量水平的苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別為30、100μg/kg和200μg/kg，每個(gè)添加量做6個(gè)平行，每個(gè)平行設(shè)一個(gè)空白對照，按樣品前處理過程處理后測定回收率。另取草魚肌肉樣品，分別添加3個(gè)水平的苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)溶液：30、100μg/kg和200μg/kg，每個(gè)濃度分別在1d內(nèi)平行測定5次，1周內(nèi)平行測定5次，計(jì)算日內(nèi)及日間精密度。測定結(jié)果見表2。由表2可以看出，苯巴比妥加標(biāo)濃度在30～200μg/kg內(nèi)，回收率為80.49%～102.42%。

實(shí)測日內(nèi)及日間精密度見表3，為3.26%～10.15%，方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合殘留分析要求。

以信噪比RSN＝3計(jì)算，該方法對水產(chǎn)品中苯巴比妥的檢出限為10μg/kg。以3倍檢出限確定定量限，為30μg/kg。

表2 樣品加標(biāo)回收率及RSD(n=6)Table 2 Recovery rates and RSDs for phenobarbital determination in spiked samples (n=6)

表3 日內(nèi)與日間精密度 (±s，n＝5)Table 3 Intra-day and inter-day precision for phenobarbital determination in spiked samples (±s，n＝5)

表3 日內(nèi)與日間精密度 (±s，n＝5)Table 3 Intra-day and inter-day precision for phenobarbital determination in spiked samples (±s，n＝5)

添加量/ 日內(nèi)精密度 日間精密度(μg/kg) 測定值/(μg/kg) RSD/% 測定值/(μg/kg) RSD/% 30 29.96±6.05 4.04 28.29±9.34 6.60 100 94.64±15.44 3.26 85.31±27.44 6.43 200 169.09±85.83 10.15 172.27±32.42 3.76

2.6 實(shí)際樣品測定

利用上述方法對從廣州市場購買的草魚、對蝦、甲魚和鰻魚樣品進(jìn)行提取和凈化，高效液相色譜定量分析，均未發(fā)現(xiàn)呈陽性。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立的分析方法可以測定水產(chǎn)品中苯巴比妥的殘留量，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于大部分的水產(chǎn)品的檢測，適用范圍較廣。當(dāng)前水產(chǎn)品質(zhì)量形勢日漸嚴(yán)峻，本方法可以為水產(chǎn)品質(zhì)量安全的研究提供參考。

[1] 鞏玉梅, 徐存軍. 苯巴比妥鈉致過敏性休克1例[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2006, 25(8): 802.

[2] 林秀萍, 陳彩華, 劉郡凌. 苯巴比妥鈉過敏致全身剝脫性皮疹1例[J].中國誤診學(xué)雜志, 2006, 6(1): 192-193.

[3] SINGH G, DRIEVE P R, SANDER J W. Cancer risk in people with epilepsy: the role of antiepileptic drugs[J]. Brain, 2005, 128(1): 7-17.

[4] PATRICK K, BRODIE M J. Phenobarbital for the treatment of epilepsy in the 21st century: a critical review[J]. Epilepsia, 2004, 45(9): 1141-1149.

[5] HOLMES L B, HARVEY E A, COULL B A, et al. The teratogenicity of anti-convulsant drugs[J]. N Engl J Med, 2001, 344(15): 1132-1138.

[6] 張海棠, 王自良, 王艷榮. 苯巴比妥在動物生產(chǎn)中的非法使用及毒性作用[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(4): 29-31.

[7] 張海棠, 王艷榮, 崔艷紅, 等. 苯巴比妥的毒副作用及其殘留檢測[J].中國飼料, 2006(9): 36-38.

[8] 陳鵬. 苯巴比妥對草魚、鰱魚苗運(yùn)輸成活率的影響[J]. 漁業(yè)致富指南, 2008(3): 55-57.

[9] 林偉萍, 丁汀, 周慧萍, 等. 反相高效液相色譜法同時(shí)測定人血清苯巴比妥與卡馬西平濃度[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2007, 26(5): 489-490.

[10] 陳蓉. HPLC法測定癇速停膠囊中苯妥英鈉和苯巴比妥含量[J]. 中國藥師, 2004, 7(8): 617-618.

[11] 陳方亮, 程亞軍. 丁丁. 反相高效液相色譜外標(biāo)法測定苯巴比妥與卡馬西平的血藥濃度[J]. 中國藥業(yè), 2006, 15(1): 65-66.

[12] 葉可人. 高效液相色譜法測定血清中卡馬西平、苯妥英鈉、苯巴比妥血藥濃度[J]. 海南醫(yī)學(xué), 2004, 15(12): 125.

[13] 楊潔, 焦正, 施孝金. 高效液相色譜法同時(shí)測定人血漿中6種抗癲癇藥物及兩種活性代謝物的濃度[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2006, 41(24): 1899-1902.

[14] 丁玉峰, 萬波, 賀國芳, 等. 高效液相色譜法測定勃氏合劑中苯巴比妥鈉和咖啡因含量[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2005, 25(7): 676-677.

[15] 王自良, 王建華, 楊艷艷, 等. 苯巴比妥殘留快速檢測阻斷ELISA試劑盒的研制及性能測定[J]. 中國獸醫(yī)雜志, 2006, 42(4): 62-64.

[16] 李桂平, 張海棠, 王自良. 動物性食品中苯巴比妥殘留檢測研究進(jìn)展[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 35(12): 3-6.

[17] 趙海香, 邱月明, 汪麗萍, 等. 氣相色譜-質(zhì)譜同時(shí)測定豬肉中3種巴比妥藥物殘留[J]. 分析化學(xué)研究報(bào)告, 2005, 33(6): 777-780.

[18] 沈曉潔, 戴月華. SPE-HPLC法測定血清中苯巴比妥苯妥英鈉和卡馬西平濃度[J]. 江蘇藥學(xué)與臨床研究, 2005, 13(1): 23-24.

Determination of Phenobarbital Residues in Fishery Products by SPE-HPLC

DAI Xiao-xin，ZHU Xin-ping*，WU Shi-hui，YIN Yi，MA Li-sha，CHEN Kun-ci，ZHENG Guang-ming，PAN De-bo
(Pearl River Fishery Research Institute, Chiese Academic of Fishery Sciences, Guangzhou 510380, China)

A solid phase extraction (SPE) coupled with high performance liquid chromatography (HPLC) method has been developed for the determination of phenobarbital residues in fishery products. Samples were extracted with ethyl acetate, defatted withn-hexane, and cleaned up on a C18 solid phase extraction cartridge before HPLC analysis. Over the concentration range of 0.05－4.0 μ g/mL, a good linear response was observed for the fitted calibration curve of phenobarbital, with a coefficient of correlation of 0.9999. The average recovery rate of phenobarbital in four types of aquatic products varied from 80.49%－102.42% with relative standard deviation (RSD) of 1.52%－10.15%. The detection limit and quantification limit of this method was 10 μg/kg and 30 μ g/kg, respectively. This method was simple and accurate and could meet the requirements for the determination and confirmation of phenobarbital residues in fishery products.

solid phase extraction；high performance liquid chromatography；fishery productsl；phenobarbital；C18 column

TS207.3

A

1002-6630(2012)18-0232-04

2011-07-12

2008漁業(yè)應(yīng)急項(xiàng)目

戴曉欣(1982—)，女，研究實(shí)習(xí)員，學(xué)士，主要從事水產(chǎn)品質(zhì)量安全研究。E-mail：wulihapa@163.com

*通信作者：朱新平(1964—)，男，研究員，博士，主要從事水產(chǎn)種質(zhì)資源與遺傳育種研究。E-mail：zhuxinping_1964@yahoo.com.cn