高效液相色譜法分析北方部分地區(qū)蜂膠醇提物成分

趙亮亮，王光新，陳 平，董 捷，張紅城,*

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093)

高效液相色譜法分析北方部分地區(qū)蜂膠醇提物成分

趙亮亮1,2，王光新2，陳 平1，董 捷2，張紅城2,*

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093)

研究北方部分地區(qū)的蜂膠提取物中組分含量的差異并對(duì)成分分析。采用乙醇水溶液對(duì)中國(guó)北方11個(gè)省市的蜂膠進(jìn)行提取，以NaNO2-Al(NO3)3比色法和Folin-Ciocalteu試劑比色法分別測(cè)定蜂膠不同提取物的總黃酮和總酚酸含量；并且借助標(biāo)準(zhǔn)品以高效液相色譜法對(duì)不同提取物中的酚類化合物進(jìn)行初步定性和定量，進(jìn)而模擬蜂膠的區(qū)域性。結(jié)果表明：不同地區(qū)的蜂膠含有的總黃酮和總酚酸不同，其中咖啡酸、坎非醇、松屬素、柯因、高良姜素、苯甲酰肉桂酯以河南蜂膠含量最高；芹菜素、異鼠李素以遼寧蜂膠含量最多；山東蜂膠含有最多的鼠李素。關(guān)鍵詞：蜂膠提取物；高效液相色譜；成分分析

蜂膠是蜜蜂從植物芽胞或樹干采集的樹膠，混入蜜蜂的上額腺、蜂蠟而形成的芳香性樹脂狀固體物質(zhì)[1]。蜂膠中含有豐富的生物活性成分，具有廣泛的生理和藥理活性。但是不同地區(qū)甚至相同地區(qū)的蜂膠所含有的活性成分都有所差異，這主要是由于蜜蜂所采集的膠原植物不同所導(dǎo)致的。巴西蜂膠中富含萜類化合物和p-香豆酸異戊烯基衍生物；而在中國(guó)大陸及歐洲，蜂膠的主要成分是多酚類物質(zhì)，其中包括酚酸和黃酮類物質(zhì)[2]。而一般用于分析植物及其相關(guān)產(chǎn)品中的酚酸和黃酮類物質(zhì)的方法有很多，比較常用的是高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)[3-4]。同時(shí)還可以串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析，這就使得這種方法在物質(zhì)檢測(cè)和分析方面得到了很快的發(fā)展。

在中國(guó)，由于地理?xiàng)l件的關(guān)系，國(guó)內(nèi)蜂膠的成分相當(dāng)復(fù)雜。目前國(guó)家的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，主要是檢測(cè)蜂膠中的8種黃酮，但是由于地域和膠源植物的差異，蜂膠的成分變化很大，例如8種黃酮中的蘆丁就只存在很小部分蜂膠中，并且含量很少。而且蜂膠的主要活性成分不僅僅是黃酮，還有酚酸和酚酸酯類，這些成分發(fā)揮著抗氧化、抗炎、抗癌等作用。然而目前的國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，沒有體現(xiàn)出這些生理活性物質(zhì)。因此，通過檢測(cè)蜂膠中8種黃酮含量已無法完全滿足蜂膠質(zhì)量評(píng)價(jià)和假膠鑒別要求[5]。

本實(shí)驗(yàn)以北方11個(gè)省市所采集的蜂膠為原料，采用超聲波輔助乙醇水溶液法進(jìn)行提取，之后利用HPLC檢測(cè)蜂膠提取物中的黃酮類和酚酸類物質(zhì)，并通過聚類分析試圖反映出蜂膠的地域具有可追溯性。通過這些實(shí)驗(yàn)可以更加有效的評(píng)價(jià)中國(guó)蜂膠及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量，對(duì)于實(shí)際生產(chǎn)具有重要指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑龍江、吉林、遼寧、北京、河北、山東、河南、陜西、安徽、湖北、甘肅11個(gè)地區(qū)的蜂膠原膠分別由當(dāng)?shù)胤滢r(nóng)采集，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所提供，粉碎后凍存；3,4-二羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、香蘭素、p-香豆酸、阿魏酸、3-羥基-4-甲氧基肉桂酸、苯甲酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、肉桂醇、楊梅酮、桑色素、肉桂酸、山奈酚、異鼠李素、芹菜素、鼠李素、松屬素、短葉松素、柯因、咖啡酸苯乙酯、高良姜素、苯甲酰肉桂酯、蘆丁、槲皮素、木犀草素、柚皮素、黃岑素、花旗松素、染料木素、沒食子酸(以上均為色譜純)、Folin-Ciocalteu試劑 美國(guó)Sigma公司；甲醇(CR) 美國(guó)Fisher公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WK-600A高速粉碎機(jī) 青州市精誠(chéng)醫(yī)藥裝備制造有限公司；AL204型分析天平 梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；Milli-Q Intergral純水/超純水一體化系統(tǒng) 美國(guó)Merk Millipore公司；KQ-50DB型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；微量移液器 德國(guó)Eppendorf公司；UV-2100型紫外-可見分光光度計(jì) UNICO(上海)儀器有限公司；HZS-H型水浴搖床 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；SY21-K型電熱恒溫水浴鍋 北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司；LGJ-12真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司； LC-6AD高效液相色譜儀(配有二極管陣列紫外檢測(cè)器(PDA)、CTO-10A柱溫箱、SIL-自動(dòng)進(jìn)樣器、LCsolution數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)) 日本島津公司； RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 蜂膠提取物的制備

準(zhǔn)確稱取10g已粉碎的各地區(qū)蜂膠，置于500mL已稱質(zhì)量的具塞錐形瓶中，分別加入200mL 75%乙醇溶液。40℃、100r/min水浴搖床中提取48h，每12h取出錐形瓶并置于超聲波清洗器中，超聲1h，共超聲4次。提取結(jié)束后，離心收集蜂膠不同提取液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后進(jìn)行真空冷凍干燥，得到的固體提取物凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液配制

準(zhǔn)確稱取一定量的3,4-二羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、香蘭素、p-香豆酸、阿魏酸、3-羥基-4-甲氧基肉桂酸、苯甲酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、肉桂醇、楊梅酮、桑色素、坎非醇、異鼠李素、芹菜素、鼠李素、松屬素、柯因、咖啡酸苯乙酯、高良姜素、苯甲酰肉桂酯，將其配成一定質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。根據(jù)各種標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間及強(qiáng)度，進(jìn)行相應(yīng)的混合，混合后標(biāo)準(zhǔn)品的濃度在0.1～0.8mg/mL。利用混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液進(jìn)行定性和定量分析。

1.3.3 樣品中總多酚含量的測(cè)定[6]

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：精確稱取0.005g沒食子酸，蒸餾水定容50mL，該標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度0.1mg/mL。準(zhǔn)確量取上述標(biāo)準(zhǔn)液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL置于10mL容量瓶中，各加入6mL蒸餾水，搖勻，再加入0.5mL 2mol/mL福林酚試劑，充分搖勻。1min之后加入1.5mL碳酸鈉溶液(20g /100mL)，混勻定容，放置10min后在765nm處測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測(cè)定時(shí)根據(jù)不同蜂膠提取物的質(zhì)量濃度不同取樣量也不同，但吸光度選取在0.2～0.8之間。樣品中總多酚用原膠中沒食子酸質(zhì)量計(jì)算。

1.3.4 樣品中總黃酮含量的測(cè)定[7]

標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：精確稱量0.01g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用60%乙醇溶液溶解，定容至100mL容量瓶中，得到質(zhì)量濃度0.1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、5、7、9、10、12mL置于25mL容量瓶中，加水補(bǔ)到12mL，搖勻，再加入5% NaNO2溶液1mL充分搖勻；放置6min之后加入10% Al(NO3)3溶液1mL搖勻；放置6min之后加入4.3% NaOH溶液10mL，充分搖勻，最后用60%乙醇溶液定容至25mL放置15min后，在波長(zhǎng)510nm處測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測(cè)定時(shí)根據(jù)不同蜂膠提取物的質(zhì)量濃度不同取樣量也不同，但吸光度選取在0.2～0.8之間。樣品中總黃酮用原膠中蘆丁質(zhì)量計(jì)算。

1.3.5 HPLC分析條件[8]

Shim-Pack PREP-ODS(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱；流動(dòng)相：甲醇-水(含0.1%乙酸溶液）；流速：1.0mL/min；檢測(cè)溫度35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280nm；進(jìn)樣量10μL；所用的梯度洗脫程序如下：0～10min、18%～28%甲醇溶液，10～35min、28%～38%甲醇溶液，35～58min、38%～50%甲醇溶液，58～70min、50%～55%甲醇溶液，70～85min、55%～59%甲醇溶液，85～95min、59%～62%甲醇溶液，95～105min、62%～70%甲醇溶液，105～120min、70%～75%甲醇溶液，120～140min、75%甲醇溶液。

1.3.6 樣品中成分的初步定性

按照相同的色譜條件，分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品混合物和不同地區(qū)的蜂膠提取液進(jìn)行液相色譜分析。根據(jù)樣品中各個(gè)組分的保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間是否重合進(jìn)行初步定性，然后進(jìn)一步根據(jù)二極管陣列檢測(cè)器所得到的紫外光譜的形狀，吸收帶以及最大吸收波長(zhǎng)與標(biāo)準(zhǔn)品的紫外光譜相比較，進(jìn)行樣品定性分析。

1.3.7 樣品中各組分定量

將1.3.2節(jié)配制的混合對(duì)照品溶液，按1.3.5節(jié)色譜條件，分別以1、5、10、15、20、2 5μL進(jìn)樣量，依次進(jìn)樣分析。以對(duì)照品的進(jìn)樣量(X)/(μg/L)對(duì)峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸分析。由標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算出各個(gè)產(chǎn)地蜂膠中各組分的含量。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

利用Excel繪制各對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)；采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，分別比較總酚和總黃酮含量在不同提取物之間的顯著性差異，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用Alphasoft軟件進(jìn)行蜂膠區(qū)域性的聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地區(qū)的蜂膠提取物中的總多酚和總黃酮含量

表1 不同地區(qū)蜂膠提取物的總多酚、總黃酮含量Table 1 Total polyphenol and total flavonoid contents in propolis extracts from different areas

從表1可知，不同地區(qū)蜂膠中的總酚酸和總黃酮含量不同，其中每克原膠的總酚酸含量范圍為81.19～199.69mg；總黃酮為139.55～368.06mg。其中河北地區(qū)的蜂膠提取物中總多酚含量最高，為(199.69±0.56)mg/g，而總黃酮含量最高的是陜西蜂膠提取物，為(368.06± 1.35)mg/g，但是通過數(shù)據(jù)分析可以看出，河北蜂膠中的黃酮含量和陜西蜂膠之間并沒有顯著差異，因而單從總體的活性成分上看，河北地區(qū)蜂膠可能是最好的，而吉林、安徽及湖北等地區(qū)的蜂膠相對(duì)較差。

不同地區(qū)蜂膠中的總多酚和總黃酮含量不同，主要與當(dāng)?shù)仫曫B(yǎng)的蜜蜂種類和蜂膠的膠原植物有關(guān)?？傮w含量與Ahn等[9]報(bào)道的中國(guó)和歐洲蜂膠中的總多酚和總黃酮含量相比差異不大。當(dāng)然即使活性成分含量較少的吉林和安徽等地的蜂膠提取物，也比其他一些天然產(chǎn)物中的多酚含量要高，如龍眼(27.4mg/g)[10]。

2.2 液相色譜條件的確定

液相色譜的最佳條件是以相鄰的兩種物質(zhì)可以明顯分開為最佳，因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行多種流動(dòng)相的選取。有機(jī)相從甲醇和乙腈中篩選，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇流動(dòng)相基線和物質(zhì)的分離情況更好，這可能是由于甲醇的水溶性和非極性相對(duì)較好。對(duì)于水相流動(dòng)，通過添加一定的酸性物質(zhì)進(jìn)去，可以有效增加物質(zhì)的溶解，阻止部分酚酸類和黃酮類物質(zhì)的解離而出現(xiàn)掛柱，導(dǎo)致目標(biāo)物質(zhì)出現(xiàn)拖尾的現(xiàn)象。在水相中加入的酸性物質(zhì)主要從磷酸、乙酸和甲酸3種物質(zhì)中篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加酸性物質(zhì)后，目標(biāo)化合物拖尾現(xiàn)象明顯減少，且分離效果和峰型都得到了明顯改善，其中磷酸和乙酸效果最好，但考慮到所用的色譜柱子是反相色譜柱，同時(shí)有機(jī)相為甲醇，易使磷酸類物質(zhì)結(jié)晶吸附在色譜柱上，對(duì)色譜柱產(chǎn)生一定的影響；并且在做質(zhì)譜分析檢測(cè)時(shí)不能使用磷酸，所以本實(shí)驗(yàn)選取乙酸作為酸性劑。

為了能夠獲得最佳的分離效果和最高的效率，對(duì)于酸性條件進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)0.2%和0.1%(V/V)的乙酸-水對(duì)峰型效果最好，但是考慮柱子耐受酸性程度，本實(shí)驗(yàn)最終選擇0.1%(V/V)的乙酸-水為水相流動(dòng)相。對(duì)于檢測(cè)波長(zhǎng)來說，多酚類物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)主要在280nm和350nm處，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在280nm處的紫外光譜吸收，較多的物質(zhì)能夠被檢測(cè)出來，且基線相對(duì)比較平穩(wěn)，所以本實(shí)驗(yàn)選取280nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

實(shí)驗(yàn)開始階段，首先進(jìn)行等濃度洗脫，但是分離效果不好，這可能是由于蜂膠中的活性成分比較復(fù)雜，難以在一個(gè)濃度條件獲得相對(duì)較好的分離效果，之后參考了一些文獻(xiàn)[8,11-12]選擇了梯度分離，并進(jìn)一步探索，得到一個(gè)相對(duì)較好的分離效果，所用分離條件如下：流動(dòng)相：甲醇-水(含0.1%乙酸）；流速：1.0mL/min；檢測(cè)溫度35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280nm；進(jìn)樣量10μL；所用梯度洗脫程序如下：0～10min、 18%～28%甲醇，10～35min、28%～38%甲醇，35～58min、38%～50%甲醇，58～70min、50%～55% 甲醇，70～85min、55%～59%甲醇，85～95min、59%～62%甲醇，95～105min、62%～70% 甲醇，105～120min、70%～75%甲醇，120～140min、75%甲醇。

2.3 中國(guó)北部地區(qū)蜂膠成分分析

首先進(jìn)行單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的分析，通過相對(duì)保留時(shí)間和紫外光譜進(jìn)行相應(yīng)定性分析，將樣品中含有且相對(duì)能夠分開的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)一步混合，得到了最終 23種物質(zhì)的混合物。標(biāo)準(zhǔn)品混合物液相圖譜見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of mixed individual compound standards

圖2 不同地區(qū)蜂膠的HPLC圖譜比較Fig.2 Comparison of HPLC chromatogram fingerprints of propolis extracts from different areas

表2 不同地區(qū)蜂膠中各組分含量Table 2 Contents of individual components in propolis extracts from different areas

由圖2可知，各地的蜂膠提取物的主要成分多數(shù)集中在75～100min之間，在75min之前和100min之后蜂膠的成分含量較低。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，75min之前多為酚酸類物質(zhì)，而在75～100min之間的多數(shù)是黃酮類物質(zhì)，而100min之后可能是酯類物質(zhì)。其中從液相圖譜的峰數(shù)可以看出，河南蜂膠提取物所含有的成分種類較多。結(jié)合表2可以看出，河北、黑龍江和河南蜂膠的成分種類最多，且以酚酸和黃酮類物質(zhì)為主要成分。酚酸以咖啡酸和p-香豆酸最為普遍且含量也相對(duì)最多，其中河南蜂膠中咖啡酸含量最多，為11.18mg/g，而黑龍江蜂膠中p-香豆酸含量最多，為13.18mg/g。從表2可以看出，按照目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定檢測(cè)蜂膠中的8種黃酮，其中坎非醇、芹菜素、松屬素、柯因、高良姜素最為普遍。在11種蜂膠中河南蜂膠的坎非醇、松屬素、柯因以及高良姜素最多，遼寧蜂膠中的芹菜素含量最大，分別為3.84、53.44、63.67、40.35、6.72mg/g。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的蜂膠中的8種黃酮類物質(zhì)，只有這5種黃酮類物質(zhì)普遍的存在于北方不同地區(qū)的蜂膠中，而楊梅酮存在的范圍較小且含量也相對(duì)較低；在所測(cè)的11個(gè)產(chǎn)地蜂膠中蘆丁、桑色素均未檢測(cè)到，這表明簡(jiǎn)單的以這8種黃酮類物質(zhì)來作為中國(guó)蜂膠的產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)存在缺陷。除了上述5種黃酮，還檢測(cè)出鼠李素和異鼠李素，且含量也相對(duì)較高，其中山東蜂膠中鼠李素含量為10.73mg/g，遼寧蜂膠中異鼠李素含量為7.87mg/g。相比而言，酚酸類物質(zhì)中咖啡酸和p-香豆酸普遍存在于所測(cè)的11個(gè)產(chǎn)地中，且含量也相對(duì)較高，此外苯甲酰肉桂酯和咖啡酸苯乙酯也比較普遍存在于所測(cè)定蜂膠中。因此在進(jìn)一步增加檢測(cè)樣品量的基礎(chǔ)上，建議在修訂國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，刪除蘆丁、桑色素和楊梅黃酮的檢測(cè)，增加鼠李素和異鼠李素，以及咖啡酸、p-香豆酸和咖啡酸苯乙酯的檢測(cè)。該結(jié)論為進(jìn)一步完善中國(guó)蜂膠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供一定理論支持。

由于不同地區(qū)的植物有著較大的區(qū)別，而蜂膠的成分主要依靠蜜蜂所采集的膠原植物的種類不同而有所不同，甚至同一地區(qū)的蜂膠，其所含有的化學(xué)成分都有著不同，使得蜂膠的植物來源性很難確定。Ahn等[9]研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)蜂膠的主要成分是柯因、高良姜素、松屬素、短葉松素，這與楊樹膠的主要成分相同。同時(shí)從本實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果來看，所測(cè)定地區(qū)的蜂膠中都含有相對(duì)較高的柯因、高良姜素、松屬素和鼠李素含量，表明這些地區(qū)的蜂膠植物源性與楊樹可能有著較大的關(guān)系。此外，有些研究者還發(fā)現(xiàn)，中國(guó)、歐洲等北半球國(guó)家的蜂膠組成成分都與楊樹膠或其滲出液有著一定的相似性[13-15]，但是由于中國(guó)蜂膠主要以酚酸和黃酮類物質(zhì)為主，所以一些黃酮類物質(zhì)含量要高于歐洲一些國(guó)家，如柯因含量要高于保加利亞蜂膠(8.4mg/g)[2,16]。然而，Volpi等[17]研究結(jié)果卻顯示中國(guó)蜂膠中不含有坎非醇和柯因，這可能是由于所使用的分析方法不同，以及選用的蜂膠產(chǎn)地不同。

2.4 不同地區(qū)蜂膠的HPLC聚類分析

圖3是利用Alphasoft軟件，將HPLC檢測(cè)到的所有峰進(jìn)行聚類分析得到的結(jié)果，它比單純的利用某幾個(gè)特定物質(zhì)峰進(jìn)行分析得到的結(jié)果更可靠，能更加全面的反應(yīng)各地區(qū)蜂膠中的成分，進(jìn)而有效的對(duì)蜂膠的區(qū)域源性進(jìn)行分析。從圖3可知，河南和陜西蜂膠的主要成分具有很大的相似性，這表明這兩地的蜂膠的膠原植物具有一定的相似性；河北、山東和遼寧地區(qū)的蜂膠具有一定的相似性；但是北京地區(qū)的蜂膠成分卻與河北蜂膠有著很大的不同，這主要是由于膠原植物和采集時(shí)間不同所導(dǎo)致的，即使是同一地區(qū)的蜂膠其成分含量上也有著很大的不同，如北京市海淀區(qū)和門頭溝區(qū)的蜂膠成分[18]。 同樣，研究發(fā)現(xiàn)安徽、湖北、黑龍江、吉林以及甘肅這些地區(qū)的蜂膠，在模擬分析中有很大的相似性。雖然這些地區(qū)在地里位置上離的相對(duì)較遠(yuǎn)，但膠原植物可能具有很大的相似性，使得這些地區(qū)的蜂膠具有很大的相似性。從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，蜂膠的區(qū)域性不可以簡(jiǎn)單的以蜂膠的產(chǎn)地來劃分，而應(yīng)以蜂膠所含有的組成成分來進(jìn)行分析確定。

圖3 中國(guó)不同地區(qū)蜂膠相似度分析Fig.3 Similarity comparison of propolis samples from different areas

3 結(jié) 論

利用乙醇溶液對(duì)11個(gè)地區(qū)的蜂膠進(jìn)行提取，測(cè)定其總多酚和總黃酮的含量，結(jié)果表明它們之間差別很大，其中河北地區(qū)的蜂膠提取物含有的總多酚含量最高，而總黃酮含量最高的是陜西蜂膠提取物，但在P＜0.05條件下，河北蜂膠中的黃酮含量和陜西的蜂膠之間并沒有顯著差異，相比較而言，吉林、安徽及湖北等地區(qū)的蜂膠含量相對(duì)較低，因此，單從總體的活性成分上看，河北蜂膠可能是最好的。

通過HPLC對(duì)蜂膠中有效成分進(jìn)行定性和定量。結(jié)果顯示，蜂膠的主要成分是酚酸和黃酮類物質(zhì)，此外還含有一些酯類和其他物質(zhì)。酚酸中以咖啡酸和p-香豆酸最為普遍且含量也相對(duì)最多，其中河南和黑龍江的含量最多；黃酮以坎非醇、芹菜素，松屬素、柯因、高良姜素最為普遍，其中河南蜂膠提取物中含有坎非醇、松屬素、柯因以及高良姜素，遼寧蜂膠提取物中含有的芹菜素最大；酯類方面苯甲酰肉桂酯和咖啡酸苯乙酰酯較為普遍。這種方法為開發(fā)蜂膠保健功能食品和藥理學(xué)研究提供了理論基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)利用Alphasoft軟件對(duì)蜂膠的全組分進(jìn)行了聚類分析，根據(jù)HPLC圖譜比較分析，可以發(fā)現(xiàn)河南和陜西蜂膠所含的成分種類最多，而北京和安徽等地的蜂膠成分種類含量相對(duì)較少。從實(shí)驗(yàn)初步鑒定的成分含量上看，河南、河北和北京相對(duì)較多，其他省份相對(duì)較少。區(qū)域性分析結(jié)果顯示，河南和陜西具有很大的相似性，河北、山東和遼寧地區(qū)的蜂膠具有一定的相似性，安徽、湖北、黑龍江、吉林以及甘肅這些地區(qū)的蜂膠相似度較大，而北京地區(qū)的蜂膠與上述蜂膠相似度相對(duì)較小，這可能是由于所產(chǎn)膠的地域、季節(jié)、樹種、蜂種的差異所導(dǎo)致的。這也表明蜂膠的區(qū)域性不能夠簡(jiǎn)單的以地理位置劃分，而應(yīng)以蜂膠的所含有的組成成分進(jìn)行分析確定。這為建立全國(guó)的蜂膠液相指紋圖譜打下一定基礎(chǔ)。

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Composition Analysis in Ethanol Extracts of Propolis Samples from Northern China

ZHAO Liang-liang1,2，WANG Guang-xin2，CHEN Ping1，DONG Jie2，ZHANG Hong-cheng2,*
(1. College of Food Science, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China；2. Bee Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China)

The purpose of this study was to compare the contents of total phenols, total flavonoids and individual components in ethanol extracts of propolis samples collected from Northern China (Beijing and 10 provinces). The content of total flavonoids and total phenols were determined by NaNO2-Al(NO3)3 method and Folin-Ciocalteau method, respectively. Quantitative and qualitative HPLC analysis of phenols in propolis extracts was carried out by comparison with standard references for geographic cluster analysis of propolis samples. The results showed that the contents of total flavonoids and total phenols of propolis samples varied with geographic origin. The highest contents of caffeic acid, kaempferol, pinocembrin, chrysin, galangin and benzyl cinnamate were found in propolis samples from Henan province; propolis samples from Liaoning province were the richest in apigenin and isorhamnetin; propolis samples from Shandong province showed the highest content of rhamnetin.

propolis extract；HPLC；composition analysis

S896

A

1002-6630(2012)18-0143-06

2012-04-17

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD33B04)；國(guó)家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助項(xiàng)目(CARS-45-KXJ18)

趙亮亮(1988—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：zll.3678@163.com

*通信作者：張紅城(1967—)，男，副研究員，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：zzhc@sohu.com