流式細(xì)胞術(shù)分析五味子乙素促進(jìn)阿霉素內(nèi)化的實(shí)驗(yàn)研究

孫德一 張鐸 王海杰 李妍

1.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，延吉，133002

2.吉林醫(yī)藥學(xué)院免疫學(xué)與病原學(xué)教研室，吉林，132013

3.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林，132013

流式細(xì)胞術(shù)分析五味子乙素促進(jìn)阿霉素內(nèi)化的實(shí)驗(yàn)研究

孫德一1張鐸2王海杰3李妍2

1.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，延吉，133002

2.吉林醫(yī)藥學(xué)院免疫學(xué)與病原學(xué)教研室，吉林，132013

3.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林，132013

[目的] 建立流式細(xì)胞術(shù)分析腫瘤細(xì)胞內(nèi)阿霉素分布的方法，并研究低濃度五味子乙素對K562細(xì)胞內(nèi)化阿霉素的影響。[方法] 體外培養(yǎng)豬內(nèi)皮細(xì)胞(pEC），以20μmol/L阿霉素處理2、4和6小時；或加入不同濃度阿霉素（0、10、20、 40、80和100μmol/L）處理4小時。培養(yǎng)K562細(xì)胞，以5μmol/L阿霉素處理2、4和6小時；或加入不同濃度阿霉素（0、2.5、5、10和20μmol/L）處理4小時。采用不同濃度（0、25、50和100μmol/ L）五味子乙素（Sch B）與阿霉素聯(lián)合處理K562細(xì)胞4小時。收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)分析阿霉素的特異熒光 。[結(jié)果] 固定濃度處理pEC（20μmol/L）和K562（5μmol/ L）后檢測，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度隨時間延長而增加，兩種細(xì)胞4小時組熒光強(qiáng)度分別達(dá)到6小時組的96.93%和95.23%/。在直方圖上，陰性和陽性細(xì)胞群界限分明。阿霉素（2.5、5和10μmol/L）單獨(dú)處理細(xì)胞的熒光強(qiáng)度分別為26.78±3.34、64.70±6.24和118.35±9.67；添加25μmol/L Sch B實(shí)驗(yàn)后熒光強(qiáng)度增加到43.45±4.25、103.74±7.36和146. 69±8.32，Sch B顯著增加了K562細(xì)胞內(nèi)阿霉素的分布（p＜0.05）。[結(jié)論] 建立的方案可快速測定細(xì)胞內(nèi)的阿霉素分布；低濃度Sch B促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)化阿霉素。

流式細(xì)胞術(shù)；阿霉素；五味子乙素

flow cytometry；adriamycin；schisandrin B

阿霉素（acriamycin）是臨床廣泛應(yīng)用的抗癌藥，為血液系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌，肝癌和胃癌等高發(fā)腫瘤的一線化療藥。但與其他化療藥類似，原發(fā)和繼發(fā)耐藥問題嚴(yán)重。阿霉素的耐藥機(jī)制復(fù)雜，但最常見的為多藥耐藥基因產(chǎn)物P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）等過度表達(dá)所導(dǎo)致[1]。五味子乙素（schisandrin B，Sch B）為五味子干果實(shí)中提取的木脂素類有效成分，可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期而抗腫瘤[2]。其體外抑制腫瘤的IC50為10～60μmol/L，但近年研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的Sch B（≤30μmol/ L）可增強(qiáng)紅白血病、乳腺癌和肝癌等腫瘤對阿霉素、紫杉醇等P-gp底物類藥物的敏感性[3]。因此，測定Sch B對腫瘤細(xì)胞內(nèi)化藥物的效率將有助研究其增敏機(jī)制，并為建立合理藥物聯(lián)合方案提供依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 豬內(nèi)皮細(xì)胞（p i g endotheliocyte, pEC ）和人紅白血病細(xì)胞K562由本室保存，小牛血清購自浙江黃巖四季青公司，F(xiàn)12和1640培養(yǎng)液購自Gibco公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純。Sch B購自中國藥品生物制品檢定所，阿霉素為Farmitalia Carlo Eeba公司產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀型號EPICS XL，由Beckman Coulter公司生產(chǎn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理

pEC細(xì)胞貼壁生長，采用含10%小牛血清F12培養(yǎng)液，在5%CO2、飽和濕度和37℃條件下培養(yǎng)。按1×105/ml接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶，恢復(fù)貼壁生長后，加阿霉素至20μmol/L，設(shè)不加阿霉素對照組，分別培養(yǎng)2，4和6小時后收集細(xì)胞；分別加阿霉素至0、10、20、40、80和100μmol/L，培養(yǎng)4小時收集細(xì)胞。K562為懸浮生長細(xì)胞，采用含10%小牛血清1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。接種K562細(xì)胞，加阿霉素至5μmol/L，同時設(shè)不加阿霉素的對照組，分別培養(yǎng)2，4和6小時后收集細(xì)胞。接種K562細(xì)胞，加入阿霉素至0、2.5、5、10、20和40μmol/ L，培養(yǎng)4小時收集細(xì)胞。為觀察五味子乙素對K562內(nèi)化阿霉素的影響，按如下分組并處理4小時后收集：加阿霉素至終濃度為0、2.5、5和10μmol/L；相同的阿霉素濃度，分別加Sch B 至終濃度為25、50和100μmol/L。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)分析

收集細(xì)胞后PBS洗2次后，立即用流式細(xì)胞儀第二熒光通道（FL2）檢測，收集數(shù)據(jù)后采用CXP軟件（Beckman coulter，USA）分析各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以3次實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示最終結(jié)果。單獨(dú)阿霉素處理組與阿霉素聯(lián)合Sch B組間相同濃度點(diǎn)的比較采用t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)用SPSS15.0軟件做統(tǒng)計(jì)分析, 檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2.結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞術(shù)分析阿霉素在細(xì)胞內(nèi)分布

流式細(xì)胞術(shù)分析阿霉素特異熒光方案：在前向散射光（FS）為橫坐標(biāo)、側(cè)向散射光(SS）為縱坐標(biāo)的散點(diǎn)圖設(shè)門A，選擇分析細(xì)胞群（圖1-A）；在F2為橫坐標(biāo)的單參數(shù)直方圖中，以不添加阿霉素對照組99%細(xì)胞為陰性設(shè)門B，B門內(nèi)細(xì)胞占選定細(xì)胞A的99.0%以上；特異熒光陽性門為C（圖1-B），用平均（Mean，M）熒光強(qiáng)度來代表阿霉素在細(xì)胞內(nèi)的分布。采用該方案分析20μmol/L 阿霉素處理K562細(xì)胞4小時的藥物分布：99%以上細(xì)胞在C門內(nèi)，與對照組比較，平均熒光強(qiáng)度為209.55(210.12-0.57）（圖1-C）。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞內(nèi)阿霉素特異熒光

阿霉素(20μmol/L）處理PEC細(xì)胞2、4和6小時，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度隨時間延而增加（圖2-A）。2和4小時熒光平均值分別為6小時組82.80%和96.93%，即作用4小時細(xì)胞內(nèi)化藥物已近該濃度下的極限。不同濃度藥物（10、20、40、80和100μmol/L）處理4小時后，細(xì)胞內(nèi)的阿霉素平均特異熒光強(qiáng)度分別為41.79、71.35、103.03、123.49和129.52，即低濃度下（≤40μmol/L，細(xì)胞內(nèi)阿酶素分布隨外液濃度增加而明顯增加；在40～100μmol/L間，阿酶素內(nèi)化增幅平緩（圖2-B）。

圖2 處理時間和藥物濃度對批pEC細(xì)胞阿霉素分布的影響

不同時間和濃度的阿霉素處理K562細(xì)胞后流式細(xì)胞術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)其趨勢與批pEC細(xì)胞相同：固定的藥物處理2和4小時，其熒光強(qiáng)度分別為6小時組的72.89%和95.39%（圖3-A）。0、2.5、5、10和20μmol/L處理4小時，細(xì)胞內(nèi)阿酶素分布隨細(xì)胞外液濃度增加而明顯增加；而濃度在20～40μmol/L間，阿霉素內(nèi)化的增幅平緩（圖3-B）

圖3 不同濃度阿霉素對K562細(xì)胞阿酶素?zé)晒獾挠绊?/p>

2.2 五味子乙素促進(jìn)K562細(xì)胞內(nèi)化阿霉素

2.5、5 和10 μmol/L阿霉素單獨(dú)處理4小時，K562細(xì)胞內(nèi)阿霉素的熒光強(qiáng)度分別為26.78±3.34、64.70±6.24和118.35±9.67；添加25μmol/L Sch B的實(shí)驗(yàn)組，熒光強(qiáng)度分別增到43.45±4.25、103.74±7.36和146.69±8.32，Sch B顯著增加了K562細(xì)胞內(nèi)阿霉素的分布（p＜0.05）。50和100μmol/L Sch B組的阿霉素的熒光強(qiáng)度高于阿霉素單獨(dú)作用組和25μmol/L Sch B，但50和100μmol/L Sch B組間無顯著差異（圖4）。以上結(jié)果表明，低濃度的Sch B即可促進(jìn)阿霉素的內(nèi)化。

3.討論

阿霉素為分子量 543.52的大環(huán)內(nèi)酯類藥物，是P-gp的靶分子。當(dāng)腫瘤原發(fā)為P-gp高表達(dá)，或化療藥物誘導(dǎo)其表達(dá)增加后，可加速阿霉素等大環(huán)內(nèi)酯類藥物被“藥泵”運(yùn)出細(xì)胞的效率，從而產(chǎn)生耐藥[4]。因此，檢測細(xì)胞內(nèi)藥物濃度對研究其耐藥機(jī)制、篩選增敏藥物和預(yù)測療效有重要意義。利用阿霉素發(fā)射的紅色熒光，我們分析了濃度和處理時間對細(xì)胞內(nèi)藥物分布的影響。藥物處理4小時熒光強(qiáng)度隨藥物濃度增加而增強(qiáng)；同時發(fā)現(xiàn)熒光在直方圖中峰值集中，陰性和陽性細(xì)胞群界限分明。因此，所建立的方案操作簡單、標(biāo)本量小，用來分析藥物濃度具有獨(dú)特優(yōu)勢。

研究報道，低濃度的Sch B可增強(qiáng)紅白血病、乳腺癌和肝癌等腫瘤對阿霉素、紫杉醇等P-gp底物類藥物的敏感性。本研究測定了不同濃度Sch B對K562細(xì)胞內(nèi)化阿霉素的影響。發(fā)現(xiàn)，低濃度的Sch B即可顯著增強(qiáng)阿霉素在細(xì)胞內(nèi)的分布?；熕幬锞卸靖弊饔?，降低藥物用量可減輕毒副作用[5]。將Sch B與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用，可通過促進(jìn)藥物內(nèi)化而形成協(xié)同作用。本研究所建立的阿霉素檢測方法，以及低濃度的Sch B促進(jìn)藥物內(nèi)化的證據(jù)，為篩選阿霉素的增敏藥物，建立合理的藥物聯(lián)合方案提供依據(jù)。

圖4 不同濃度阿霉素對K562細(xì)胞內(nèi)化阿霉素的影響

[1]梁軍，宋曉玉，劉志新，李月珍. 五味子乙素對人胃癌細(xì)胞株MGC-803凋亡的影響.中國老年病學(xué)雜志，2011，31(1）：88～90.

[2]苗迎秋,李志,高文倉. 阿霉素誘導(dǎo)的卵巢癌耐藥細(xì)胞P- 糖蛋白的表達(dá). 大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2010,32(1）:35～40.

[3]李凌, 王弢,許志良,俞穎,陳衛(wèi),陳菲. 五味子乙素對轉(zhuǎn)染多藥耐藥1基因的MCF-7細(xì)胞的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)作用. 中華醫(yī)學(xué)雜志，2005，85(23）：1633～1637.

[4]孫華, 劉耕陶.五味子果仁醇提取物含藥血清逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥及抑制耐藥糖蛋白( P-gp）的作用.中國新藥雜志，2009，18（12）：1130～1135.

[5]傅軍，俞杰，徐宏彬，李玲. 中醫(yī)藥輔助實(shí)體腫瘤化療增效減毒的系統(tǒng)性評價.中醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，16（10）：108～112.

Analyzing the promotion of internalization of adriamycin by schisandrin B through flow cytometry

Sun Deyi 1, Zhang Duo 2, Wang Haijie 3, Li Yan 2
1. The Department of Pharmacy in The Medical College of Yanbian Univercity,Yanji, 1330022. The Department of Immunology and Etiology of Jilin Medical College,Jilin, 132013
3. The Department of Pharmacy of Jilin Medical College,Jilin, 132013

Objective: To establish a method to analyze content of adriamycin in tumor cells by flow cytometry (FCM）and to analyze the effect of internalization of adriamycin into tumor cells promoted by schisandrin B. Method: Pig endothelia cells (pEC）were cultured with or without 20μmol/L adriamycin for indicated time ( 2, 4and 6hours）, or in the presence of different concentration (0,10,20,40and 80μmol/L ）of adriamycin for 4hours. Human erythroleukemia cells K562were cultured with or without 5μmol/L adriamycin for indicated time (2, 4and 6hours）, or in the presence of different concentration (0, 2.5, 5, 10and 20μmol/ L ）of adriamycin for 4hours. K562cells were treated by different concentration of adriamycin in the presence of schisandrin B (0，25，50and 1005μmol/L）. The specific red fluorescence of adriamycin in those cells were detected by FCM. Result: The fluorescence in pEC and K562cells treated by determined concentration of adriamycin (10μmol/L or 5μmol/L）increased timedependently. Compared with cells treated for 6hours, cells treated for 4hours presented almost 96.93% and 95.23of fluorescence. Fluorescence positive and negative cells were distinct well in the histograms. The fluorescence in K562cells treated by adriamycin ( 2, 5and105μmol/ L）along were 26.78±3.34、64.70±6.24and 118.35±9.67.The addition of 25μmol/ L Sch B promoted the internalization of adriamycin to 43.45±4.25、103.74±7.3and 146.69±8.32( p＜0.05）. Conclusion: The method to analyze content of adriamycin in tumor cells by FCM was established .It was confirmed that lower concentration of Sch B could promoted the internalization of adriamycin .

10.3969/j.issn.1001-8972.2012.07.092

吉林省教育廳十二五科研基金（編號2011420）

，李妍（1972-），女，博士，副教授，從事細(xì)胞與分子免疫學(xué)研究工作。