小麥面筋蛋白水解物對(duì)釀酒酵母增殖和發(fā)酵性能的影響

莫 芬，趙謀明，趙海鋒

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州 510640）

小麥面筋蛋白水解物對(duì)釀酒酵母增殖和發(fā)酵性能的影響

莫 芬，趙謀明，趙海鋒*

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州 510640）

研究了小麥面筋蛋白水解物對(duì)釀酒酵母增殖和發(fā)酵性能的影響，結(jié)果表明，不同水解度的小麥面筋蛋白水解物對(duì)釀酒酵母的促增殖和發(fā)酵效果不同，其中水解度為13.96%的水解物具有最強(qiáng)的促酵母增殖和發(fā)酵效果，該水解物可使穩(wěn)定期酵母生物量提高37.0%，表觀發(fā)酵度提高8.8%，乙醇產(chǎn)量提高6.4%，氨基氮利用率提高13.0%，同時(shí)發(fā)酵時(shí)間縮短14.3%。

小麥面筋蛋白水解物，釀酒酵母，增殖，發(fā)酵

啤酒釀造過(guò)程中，酵母必須通過(guò)吸收麥汁中的含氮化合物用于合成酵母細(xì)胞核酸、蛋白質(zhì)和其他含氮化合物，繁殖細(xì)胞等。但由于啤酒酵母的胞外蛋白酶活力較低，麥汁中大分子蛋白質(zhì)很難被酵母利用[1]，因此酵母生長(zhǎng)所需要的氮源主要來(lái)自麥汁中的小分子肽和游離氨基酸[2]。此外，啤酒釀造企業(yè)為了降低成本和提高設(shè)備利用率，在啤酒生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用高濃稀釋和高輔料釀造工藝。高比例糖漿和輔料的添加降低了酵母生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（主要是氮源），使酵母生長(zhǎng)受到抑制，影響發(fā)酵[3]。因此，尋找低值、有效的麥汁補(bǔ)充氮源應(yīng)用于啤酒工業(yè)具有重要的研究意義。生物活性肽用于食品發(fā)酵工業(yè)中作為補(bǔ)充氮源對(duì)微生物生長(zhǎng)和代謝的促進(jìn)作用已有報(bào)道。萬(wàn)春艷等[4]已證實(shí)大豆蛋白水解物對(duì)酵母有明顯地促生長(zhǎng)和促發(fā)酵效果，發(fā)現(xiàn)分子量在3ku以下的肽有顯著地促生長(zhǎng)活性。Zhang等[5]發(fā)現(xiàn)酪蛋白活性肽（＜3ku）對(duì)乳酸菌有顯著促生長(zhǎng)活性，并能顯著縮短酸奶發(fā)酵時(shí)間，提高成品酸奶中乳酸菌的數(shù)量。小麥面筋蛋白是小麥淀粉加工的副產(chǎn)品，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但由于其溶解性較差而限制了其在食品發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用。目前已經(jīng)從小麥面筋蛋白水解物中分離出了多種活性多肽，如具有免疫活性的IAP肽，具有抗菌性的面筋外啡肽，A5（GYYPT），B4，B5 and C（YPISL）肽段[6-7]。張影陸等[8]研究證實(shí)了小麥面筋蛋白水解物可用做啤酒發(fā)泡蛋白，其蛋白水解物可以明顯改善純生啤酒的泡沫穩(wěn)定性。但小麥面筋蛋白水解物對(duì)酵母增值和發(fā)酵方面的研究，目前尚無(wú)報(bào)道。本文初步研究了不同水解度的小麥面筋蛋白水解物對(duì)釀酒酵母增殖和發(fā)酵性能的影響，以期探索小麥面筋蛋白活性肽作為麥汁補(bǔ)充氮源在啤酒工業(yè)中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

小麥面筋蛋白 蛋白含量70.95%，河南蓮花集團(tuán)；Pancreatin 酶活力1.2×105U/g，諾維信酶制劑公司；60°P高濃麥葡糖漿 廣州珠江啤酒有限公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）FBY0095 華南理工大學(xué)食品生物技術(shù)研究室。

全自動(dòng)糖化儀 杭州博日科技有限公司；低溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；BSD-150型全溫振蕩培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Waters 600型高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；YX-280型高壓滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠；KDN-2C型蛋白質(zhì)測(cè)定儀 上海纖檢儀器有限公司；TIM 840型自動(dòng)電位滴定儀 Radiometer-Analytical公司；APV-1000型均質(zhì)機(jī) 丹麥APV公司；PHS-3E型酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠；3-18K型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)sigma公司；電子顯微鏡 廣州市明美科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小麥面筋蛋白水解物的制備 小麥面筋蛋白按1∶10（m/v）溶于水，均質(zhì)，調(diào)pH至9.0，置于50℃恒溫水浴中添加適量pancreatin恒溫酶解。分別在不同時(shí)間取樣，于沸水浴中滅酶10m in，離心（4℃，8000r/m in，10m in），取清液進(jìn)行冷凍干燥處理，獲得三種不同水解程度的小麥面筋蛋白水解物WG-L（6.02%）、WGM（10.06%）和WG-H（13.96%）。

1.2.2 麥汁制備及發(fā)酵條件 麥汁制備：麥芽粉碎，按照常規(guī)麥汁制備工藝獲得12°P定型麥汁，同時(shí)將60°P麥葡糖漿加去離子水調(diào)至12°P，利用糖漿將麥汁中FAN（游離氨基氮）稀釋至140mg/L，121℃滅菌15m in。

發(fā)酵條件：種子擴(kuò)培見(jiàn)參考文獻(xiàn)[9]。向麥汁中添加1%（m/v）的小麥面筋蛋白水解物（實(shí)驗(yàn)組為不同水解度的小麥面筋蛋白水解物WG-L、WG-M和WG-H，對(duì)照組為不添加小麥面筋蛋白水解物的空白對(duì)照CK），調(diào)pH至5.0，121℃滅菌15m in。使用2000m L三角瓶進(jìn)行厭氧發(fā)酵，裝液量為500m L，按4g（酵母泥）/L接種量接入酵母，在低溫培養(yǎng)箱（12℃）進(jìn)行發(fā)酵，每天搖瓶2次。

1.3 分析方法

1.3.1 水解度（DH）測(cè)定 采用甲醛滴定法測(cè)定氨態(tài)氮含量，凱氏定氮法測(cè)定總氮含量[10-11]。

DH（%）=（上清液中氨基酸態(tài)氮含量/酶解液中總氮含量）×100

1.3.2 發(fā)酵過(guò)程參數(shù)測(cè)定 發(fā)酵液糖度、表觀發(fā)酵度、生物量、菌體活性及乙醇濃度的測(cè)定見(jiàn)參考文獻(xiàn)[9]。

1.3.3 游離氨基氮（FAN）的測(cè)定 采用茚三酮比色法，具體見(jiàn)參考文獻(xiàn)[12]。

1.3.4 小麥面筋蛋白水解物分子量的測(cè)定 高效液相色譜法。a.色譜柱：TSK gel 2000SXL凝膠柱，7.8mm× 300mm，預(yù)柱：C18，柱溫：30℃；b.流動(dòng)相：100%磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）；流速：1.0m L/m in；進(jìn)樣量：20μL；洗脫時(shí)間：20min；c.檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同水解度的小麥面筋蛋白水解物對(duì)酵母增殖的影響

圖1 不同水解度的小麥面筋蛋白水解物對(duì)釀酒酵母增殖的影響Fig.1 Effect ofwheatgluten hydrolysateswith different DH on the propagation of brewer’s yeast

圖2 不同水解度的小麥面筋蛋白水解物對(duì)釀酒酵母活性的影響Fig.2 Effect ofwheatgluten hydrolysateswith different DH on the viability of brewer’s yeast

表1 不同水解度的小麥面筋蛋白水解物中肽的分子量分布Table 1 Molecularweight distributions of wheatgluten hydrolysateswith different DH

選取3種不同水解度的小麥面筋水解物分別添加到麥汁中進(jìn)行發(fā)酵，以考察不同水解度的小麥蛋白水解物對(duì)釀酒酵母增殖及活性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。由圖1可知，在四種不同條件的麥汁發(fā)酵過(guò)程中，酵母均經(jīng)歷延滯期、對(duì)數(shù)期，在發(fā)酵第4d達(dá)到穩(wěn)定期，呈現(xiàn)出典型的增長(zhǎng)方式。其中添加DH 13.96%的小麥面筋蛋白水解物的實(shí)驗(yàn)組酵母在穩(wěn)定期生物量比發(fā)酵初期增長(zhǎng)了74.0%，空白對(duì)照組增長(zhǎng)僅38.0%，且穩(wěn)定期各組之間酵母增殖量具有顯著性差異（p＜0.05），其中WG-H的增殖量最大。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)各組的酵母生物量減少，但均少于對(duì)照組。由圖2可知，各組酵母活性均隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，但WG-L組與WG-H組酵母的平均活性較對(duì)照組分別提高了1.7%和5.0%。而且發(fā)酵結(jié)束時(shí)，WG-H組酵母活性仍維持在92.6%，活性相對(duì)最高。由此可見(jiàn)，小麥面筋蛋白水解物在一定程度上能夠促進(jìn)酵母增殖，提高酵母活性，而且水解度較高的小麥面筋蛋白水解物促酵母增殖的效果較為明顯。小麥面筋蛋白水解物主要是肽類物質(zhì)，本研究表明，其可以作為外加氮源應(yīng)用于啤酒發(fā)酵，在麥汁中氮源水平較低時(shí)，能夠促進(jìn)酵母的增殖，是酵母可以利用的有效外加氮源。

不同水解度的小麥面筋蛋白水解物中肽的分子量分布見(jiàn)表1。由表1可以看出，水解度越高，分子量在3ku以下的肽含量越多，表明小麥面筋蛋白水解物中對(duì)酵母增殖起作用的肽主要集中在小分子量段。小麥面筋蛋白水解物的促增殖機(jī)理可能是由于WG-H具有更多小分子肽[13]，這些小分子肽在發(fā)酵過(guò)程中更容易被酵母細(xì)胞利用，起到補(bǔ)充氮源的作用。類似的研究也有報(bào)道，Ikeda K等[14]研究認(rèn)為大豆肽可以影響酵母細(xì)胞的脂質(zhì)代謝系統(tǒng)，從而改變酵母細(xì)胞的某些特性，因此可以用作改變微生物性能的修飾因子，同時(shí)他們也發(fā)現(xiàn)大豆肽可以促進(jìn)酵母生長(zhǎng)。此外，小分子大豆肽對(duì)益生菌的促進(jìn)機(jī)理可能是寡肽比氨基酸更利于吸收[15]。Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)酪蛋白肽（分子量小于3ku的6肽或7肽）能有效地促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)，促進(jìn)發(fā)酵并提高酸奶的品質(zhì)。盡管小麥面筋蛋白肽對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響方面目前未有相關(guān)研究，但小麥面筋蛋白組成中，Glu和Pro含量高，其中Glu含量高達(dá)37.5g/100g[17]。Glu是酵母能利用的A類氨基酸[2]，小麥面筋蛋白中富含Glu，在某種程度上為釀酒酵母的促進(jìn)作用提供了可能性。但這些小分子面筋蛋白肽對(duì)酵母的生理功能，以及酵母的具體吸收利用機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。

2.2 不同水解度的小麥面筋蛋白水解物對(duì)酵母發(fā)酵性能的影響

由圖3、圖4可知，不同DH的水解物都使酵母代謝糖和產(chǎn)乙醇的速率增加。小麥面筋蛋白水解物的添加使發(fā)酵末期發(fā)酵液最終殘?zhí)潜葘?duì)照組明顯降低，最終乙醇濃度也較高，發(fā)酵性能比對(duì)照組有了顯著提高。這些結(jié)果說(shuō)明，小麥面筋蛋白水解物有明顯提高酵母細(xì)胞生理活性的作用。表2顯示，發(fā)酵結(jié)束后各基本指標(biāo)，結(jié)果表明添加不同DH的面筋蛋白水解物均可以使常濃發(fā)酵提前一天達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)（以表觀發(fā)酵度80%作為發(fā)酵終點(diǎn)指標(biāo)），對(duì)照組則需在發(fā)酵第7d達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)。與對(duì)照組相比，MG-H表觀發(fā)酵度提高8.8%，發(fā)酵周期縮短14.3%，乙醇產(chǎn)量提高6.4%，說(shuō)明小麥面筋蛋白水解物具有較明顯地促發(fā)酵性能。在酵母的發(fā)酵過(guò)程中，氮源和碳源是主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在酵母代謝糖的過(guò)程中有非常重要的作用。添加小麥面筋蛋白水解物提高了麥汁中的氮源水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，這些氮源能有效提高酵母的發(fā)酵性能。一方面發(fā)酵速率的提高來(lái)自酵母增殖及活性的提高，另一方面小分子（＜1ku）面筋蛋白活性肽可能在某種程度上促進(jìn)酵母的細(xì)胞代謝機(jī)制，促進(jìn)其對(duì)糖類物質(zhì)的利用效率，提高酵母發(fā)酵性能。相關(guān)機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

圖3 不同水解度面筋蛋白水解物對(duì)釀酒酵母糖代謝的影響Fig.3 Effectofwheatgluten hydrolysateswith different DH on the sugar consumption of brewer’s yeast

圖4 不同水解度小麥面筋蛋白水解物對(duì)釀酒酵母乙醇生成的影響Fig.4 Effectofwheatgluten hydrolysateswith different DH on the ethanol yield of brewer’s yeast

2.3 不同水解度小麥面筋蛋白水解物對(duì)酵母利用麥汁FAN的影響

由表3可知，由于添加了小麥面筋蛋白水解物，實(shí)驗(yàn)組初始FAN均有大幅度的提高，但發(fā)酵結(jié)束時(shí)各組發(fā)酵液中殘余FAN無(wú)顯著差異。其中MG-M和MG-H的利用率達(dá)到了88.8%和86.1%，對(duì)照組只有76.3%，氮基源利用率分別提高了16.5%和13.0%。氨基氮利用率的提高進(jìn)一步說(shuō)明了外加氮源能被釀酒酵母利用，是酵母生長(zhǎng)的可適氮源。因此，研究新氮源啤酒的釀造技術(shù)，能在一定程度上降低麥芽使用量，從而降低啤酒的生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益[18]。

表2 添加不同水解度水解物對(duì)釀酒酵母發(fā)酵性狀的影響Table 2 Effect ofwheatgluten hydrolysateswith different DH on the fermentation performance of brewer’s yeast

表3 添加不同水解度水解物的麥汁在發(fā)酵過(guò)程中酵母對(duì)FAN的利用情況Table 3 Effectofwheat gluten hydrolysateswith different DH on the FAN utilization rate of brewer’s yeast

3 結(jié)論

3.1 小麥面筋蛋白水解物能夠促進(jìn)酵母的增殖，同時(shí)對(duì)酵母活性也有一定的保護(hù)作用，是酵母生長(zhǎng)的有效氮源。

3.2 不同水解度的小麥面筋蛋白水解物對(duì)酵母促增殖和發(fā)酵效果不同，其中水解度13.96%的水解物促進(jìn)作用最大，能使穩(wěn)定期酵母生物量提高37.0%，表觀發(fā)酵度提高8.8%，發(fā)酵時(shí)間縮短14.3%，乙醇產(chǎn)量提高6.4%，同時(shí)酵母活性達(dá)到92.6%。

3.3 氨基氮的利用率方面，添加MG-M和MG-H的麥汁氮源利用率分別提高了16.5%和13.0%。FAN利用率的提高，進(jìn)一步驗(yàn)證了外加小麥面筋蛋白水解物的有效性。

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Effect ofwheat gluten protein hydrolysates on the propagation and fermentation performance of brewer’s yeast

MO Fen，ZHAO M ou-m ing，ZHAO Hai-feng*
（College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

Effect of wheat g luten p rotein hyd rolysates treated w ith pancreatin on p ropagation and fermentation performance of brewer’s yeast were studied.Results showed that wheat g luten p rotein hyd rolysates w ith d ifferent degree of hyd rolysis（DH）varied in p ropagation and fermentation-p romoting activity for yeast strains. Hyd rolysates w ith DH of 13.96%showed the highest p ropagation-p romoting activity and could p romote yeast fermentation significantly.Supp lement of wheat g luten p rotein hyd rolysates w ith DH of 13.96%during fermentation resulted in the increases of biomass，fermentation deg ree，ethanol yield and the utilization rate of free am ino nitrogen by 37.0%，8.8%，6.4%and 13.0%，respectively.Moreover，the fermentation time was reduced significantly by 14.3%.

wheatg luten p rotein hyd rolysates；b rewer’s yeast；p ropagation；fermentation

TS261.1

A

1002-0306（2012）18-0222-04

2012－05－10 *通訊聯(lián)系人

莫芬（1988-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010A010500002，2011A020102001）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（2012ZM0069）。