植物乳桿菌ZS2058生物轉(zhuǎn)化共軛亞油酸反應(yīng)條件的優(yōu)化研究

陳海琴，楊 波，許慶炎，宋元達(dá)，陳 衛(wèi)，張 灝

（江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫 214122）

植物乳桿菌ZS2058生物轉(zhuǎn)化共軛亞油酸反應(yīng)條件的優(yōu)化研究

陳海琴，楊 波，許慶炎，宋元達(dá)，陳 衛(wèi)*，張 灝

（江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫 214122）

對本實驗室從泡菜中篩選到的植物乳桿菌ZS2058完整細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化共軛亞油酸的反應(yīng)條件進(jìn)行了系統(tǒng)研究。在1mL磷酸鉀緩沖液反應(yīng)體系中，通過單因素實驗和響應(yīng)面分析，確定最合適的反應(yīng)條件為：亞油酸底物濃度為0.8mg/mL，細(xì)胞濃度為4×1010cfu/mL，反應(yīng)溫度為37℃，緩沖液pH為6.7。在此反應(yīng)條件下，cis9，trans11-CLA的濃度為374.24μg/mL，轉(zhuǎn)化率高達(dá)46.78%，這對于實現(xiàn)共軛亞油酸的高效生產(chǎn)和研究其生理功能具有重要的現(xiàn)實意義和理論價值。

共軛亞油酸，生物轉(zhuǎn)化，植物乳桿菌，轉(zhuǎn)化率

共軛亞油酸（Conjugated Linoleic Acid，CLA）是一類由亞油酸（Linoleic Acid，LA）衍生的具有共軛雙鍵的異構(gòu)體的總稱，在共軛亞油酸的各種異構(gòu)體中，c9，t11-CLA和t10，c12-CLA兩種異構(gòu)體被認(rèn)為最具生物活性，特別是c9，t11-CLA在抗動脈粥樣硬化和延緩機體免疫力衰退等方面起著重要作用，c9，t11-CLA是唯一能被動物細(xì)胞吸收進(jìn)入其磷脂層的共軛亞油酸異構(gòu)體[1-2]，而t10，c12-CLA在減肥等[3]方面具有明顯的效果。目前，共軛亞油酸的合成方法主要有化學(xué)法和生物法兩種，但是，化學(xué)法合成共軛亞油酸在其產(chǎn)品中存在多種異構(gòu)體，并且在終產(chǎn)品中會有溶劑殘留，甚至還會產(chǎn)生一些難以處理的反應(yīng)副產(chǎn)物[4]。而生物合成法較化學(xué)法具有異構(gòu)體成分單一、反應(yīng)條件溫和以及產(chǎn)物中具有較高活性的c9，t11-CLA含量高等特點[5]，近年來已成為研究熱點。利用微生物全細(xì)胞進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化具有轉(zhuǎn)化效果好、不需添加輔酶及其再生系統(tǒng)等優(yōu)點，細(xì)胞中轉(zhuǎn)化用酶或酶系的存在是決定性因素，而選擇一個最佳的反應(yīng)條件能使酶的催化效率顯著提高，原因是酶蛋白的立體結(jié)構(gòu)、活性中心的構(gòu)象受各反應(yīng)條件的影響，包括底物濃度、反應(yīng)介質(zhì)的pH、反應(yīng)溫度等[6-8]。本實驗室已經(jīng)篩選到一株具有生物轉(zhuǎn)化CLA能力的植物乳桿菌ZS2058，已對其在磷酸鉀緩沖溶液體系中的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了初步探討[9]。在此基礎(chǔ)上，本文以植物乳桿菌ZS2058完整細(xì)胞為研究對象，通過對影響其催化轉(zhuǎn)化的各反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化研究，這為了解其催化轉(zhuǎn)化機理，實現(xiàn)生物法高效合成CLA提供了理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌（L.plantarum ZS2058） 本實驗室從自制泡菜中分離篩選所得[10]，選用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行實驗；亞油酸 純度≥95%，本實驗用脲包法制備；共軛亞油酸 純度≥99%，美國SIGMA公司；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

GC2010氣相色譜儀 日本島津公司；UNIVERSAL32R冷凍離心機 德國HETTICH公司；BPX-70毛細(xì)管色譜柱 120m×0.25mm i.d.×0.25μm，SGE公司；其余為實驗室常規(guī)儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 氣相色譜法（GC） 在前期工作[11]基礎(chǔ)上作了改進(jìn)，具體如下：

1.2.1.1 氣相色譜條件 柱前壓：366.3kPa；進(jìn)樣口溫度：250℃；檢測器溫度：250℃；空氣壓力：50kPa；氫氣壓力：60kPa；氮氣壓力：100kPa。

1.2.1.2 程序升溫條件 150℃保持5m in，然后以5℃/m in的升溫速率將溫度升至190℃，在此溫度下保持0.1m in，再以3℃/m in的升溫速率將溫度升至220℃，在此溫度下保持15m in。分流比：5∶1，進(jìn)樣量：1μL。

1.2.1.3 計算轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中CLA的濃度 采用峰面積歸一化法計算轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中CLA的濃度。

1.2.2 細(xì)胞收集 從斜面挑取菌種在10m L MRS培養(yǎng)基中連續(xù)活化兩次，以體積分?jǐn)?shù)1%接種量接入400m LMRS培養(yǎng)基，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)（0.5mg/m L LA誘導(dǎo)）12h。培養(yǎng)結(jié)束后冷凍離心（4500×g，10min，4℃）收集菌體，并用無菌生理鹽水洗滌兩次，洗滌后直接收集細(xì)胞或用0.1mol/L的磷酸鉀緩沖溶液（pH 6.5）制成細(xì)胞懸浮液備用。

1.2.3 反應(yīng)條件優(yōu)化實驗

1.2.3.1 反應(yīng)時間對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響 分別取1m L細(xì)胞懸浮液置于10m L具塞磨口三角瓶中，添加LA乳濁液至終濃度為0.8mg/m L，使細(xì)胞濃度約為4.0×1010cfu/m L，于37℃ 200r/m in條件下分別反應(yīng)0、1、2、3、4、5、6、8、10、12、16、20、24、26、28h后取出，提取脂肪酸經(jīng)甲酯化后進(jìn)行GC分析，研究不同反應(yīng)時間生物轉(zhuǎn)化CLA的情況，確定生物轉(zhuǎn)化CLA合適的反應(yīng)時間。

1.2.3.2 氧環(huán)境對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響 分別取1m L細(xì)胞懸浮液置于10m L含有不同氧氣濃度（厭氧、微氧和好氧）的三角瓶中，添加LA乳濁液至終濃度為0.8mg/m L，使細(xì)胞濃度約為4.0×1010cfu/m L，于37℃200r/m in條件下反應(yīng)24h后取出，提取脂肪酸經(jīng)甲酯化后進(jìn)行GC分析，研究植物乳桿菌ZS2058在厭氧、微氧和好氧條件下對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響，確定最佳氧氣條件。無氧條件：在10m L具塞磨口三角瓶中，加入1m L細(xì)胞懸浮液，充N22m in，排凈三角瓶中的空氣，迅速將磨口塞塞緊。微氧條件：在10m L具塞磨口三角瓶中，加入1m L細(xì)胞懸浮液，將磨口塞塞緊，保留三角瓶中9m L的空氣。有氧條件：在10m L敞口三角瓶中，加入1m L細(xì)胞懸浮液，用棉布包扎好瓶口，防止空氣中的雜質(zhì)進(jìn)入，使三角瓶與外界空氣流通。

1.2.3.3 細(xì)胞濃度對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響 將收集到的細(xì)胞用磷酸鉀緩沖溶液稀釋成不同細(xì)胞濃度的細(xì)胞懸浮液，取1m L懸浮液于10m L具塞磨口三角瓶中，添加LA乳濁液至終濃度為0.8mg/m L，使菌體細(xì)胞濃度分別為0、1.0×1010、2.0×1010、3.0×1010、4.0×1010、5.0×1010、6.0×1010cfu/m L，于37℃200r/min條件下反應(yīng)24h后取出，提取脂肪酸經(jīng)重氮甲烷直接甲酯化后進(jìn)行GC分析，研究細(xì)胞濃度對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響。

1.2.3.4 底物L(fēng)A濃度對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響 取1m L細(xì)胞懸浮液于10m L具塞磨口三角瓶中，分別添加LA乳濁液至終濃度為0、0.1、0.3、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0、3.0mg/m L，此時菌體細(xì)胞濃度約為4.0×1010cfu/m L，于37℃200r/m in條件反應(yīng)24h后取出，提取脂肪酸經(jīng)重氮甲烷甲酯化后進(jìn)行GC分析，研究底物濃度對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響。

1.2.3.5 反應(yīng)緩沖液pH對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響 將收集到的細(xì)胞分別用不同pH 4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5的磷酸鉀緩沖溶液進(jìn)行懸浮，分別取1m L懸浮液于10m L具塞磨口三角瓶中，添加LA乳濁液至終濃度為0.8mg/m L，使菌體細(xì)胞濃度約為4.0×1010cfu/m L，于37℃200r/m in條件下反應(yīng)24h后取出，提取脂肪酸經(jīng)甲酯化后進(jìn)行GC分析，研究pH對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響。

1.2.3.6 反應(yīng)溫度對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響 取1m L細(xì)胞懸浮液于10m L具塞磨口三角瓶中，添加LA乳濁液至終濃度為0.8mg/m L，此時菌體細(xì)胞濃度約為4.0× 1010cfu/m L，分別于不同的溫度條件下（7、17、27、37、47、57℃）200r/m in反應(yīng)24h后取出，提取脂肪酸經(jīng)重氮甲烷甲酯化后進(jìn)行GC分析，研究反應(yīng)溫度對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響。

1.2.3.7 響應(yīng)面分析法優(yōu)化生物轉(zhuǎn)化CLA的條件 根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選取生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中影響顯著的底物濃度、細(xì)胞濃度和pH三個因素為自變量，以CLA的產(chǎn)量為響應(yīng)函數(shù)，三因素三水平的實驗設(shè)計方案見表1，響應(yīng)面圖的繪制和數(shù)據(jù)處理均采用SAS軟件。

表1 響應(yīng)面實驗設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels of response surfacemethodology

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)時間對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響

反應(yīng)時間的長短會對生物轉(zhuǎn)化CLA有直接影響，若反應(yīng)時間太短，則CLA的積累不充分；若反應(yīng)時間太長，則CLA易被氧化。反應(yīng)進(jìn)程曲線見圖1，結(jié)果表明，在整個反應(yīng)過程中，前8h可認(rèn)為是異構(gòu)化反應(yīng)的初始階段，有利于CLA的積累，在此階段c9，t11-CLA的產(chǎn)量隨著反應(yīng)時間的推移呈線性增加；8h之后的反應(yīng)速度增加緩慢，當(dāng)反應(yīng)至15h時，c9，t11-CLA的產(chǎn)量又開始線性增加，直到22h后，CLA的產(chǎn)量不再增加。而t，t-CLA的濃度在整個反應(yīng)的過程中略微上升。

從這個過程還觀察到c9，t11-CLA的產(chǎn)量呈現(xiàn)了二次增長的過程，分析其原因，可能與亞油酸異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化CLA存在明顯的底物抑制作用有關(guān)，關(guān)于其二次增長的機理，將會在后續(xù)工作中進(jìn)一步研究。

圖1 反應(yīng)進(jìn)程曲線圖Fig.1 The curve of reaction of the process

2.2 氧環(huán)境對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響

CLA中存在共軛雙鍵，極易被氧化，因此可通過控制反應(yīng)體系中的氧氣條件防止其被氧化。據(jù)Ogawa等[8]報道，利用乳酸菌洗滌細(xì)胞的催化能力在微氧條件下更有利于CLA的積累，具有更好的發(fā)展前景。這和鈕曉燕[9]報道的植物乳桿菌ZS2058生物轉(zhuǎn)化CLA不受氧氣濃度的限制，并且CLA的氧化程度亦不會受氧氣濃度的影響的結(jié)論不一致。本文通過改變反應(yīng)體系中不同的氧環(huán)境來研究無氧、微氧和有氧條件對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響。圖2、圖3結(jié)果顯示，植物乳桿菌ZS2058在無氧條件下生物轉(zhuǎn)化CLA時有大量的LA轉(zhuǎn)化成了t，t-CLA；在微氧條件下轉(zhuǎn)化時，LA轉(zhuǎn)化成c9，t11-CLA的比例較高；而在好氧條件下轉(zhuǎn)化時，LA轉(zhuǎn)化成c9，t11-CLA和t，t-CLA的比例相當(dāng)。

圖2 不同含氧環(huán)境下生物轉(zhuǎn)化CLA的GC圖Fig.2 Gas chromatograms of CLA methyl esters produced under different oxygen content

由于c9，t11-CLA被公認(rèn)為是最具有活力的CLA之一，是唯一能被動物細(xì)胞吸收進(jìn)入其磷脂層的共軛亞油酸異構(gòu)體，而關(guān)于t，t-CLA的功能活性未見報道，且關(guān)于分離獲得單個異構(gòu)體的技術(shù)尚未成熟。因此本文選擇在微氧條件下進(jìn)行反應(yīng)，一方面可以得到較高含量的c9，t11-CLA，另一方面，專一性轉(zhuǎn)化c9，t11-CLA的比例較高，減輕了分離c9，t11-CLA和t，t-CLA的工作。氧環(huán)境對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響實驗表明，活性CLA的產(chǎn)量與氧氣濃度的大小有著密切的聯(lián)系。

圖3 氧氣對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響Fig.3 Effectof oxygen on the bioconversion of CLA

2.3 細(xì)胞濃度對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響

利用微生物合成CLA，其實質(zhì)是利用細(xì)胞中的酶或酶系異構(gòu)化LA。因此，在利用植物乳桿菌ZS2058完整細(xì)胞催化轉(zhuǎn)化的反應(yīng)體系中，可通過改變體系中的細(xì)胞濃度來調(diào)節(jié)參與反應(yīng)的酶量，進(jìn)而獲得較好的轉(zhuǎn)化效果。從圖4可以看出，當(dāng)細(xì)胞濃度為4× 1010cfu/m L時，c9，t11-CLA產(chǎn)量比較高，隨著細(xì)胞濃度進(jìn)一步增加，酶量逐漸過量，反應(yīng)達(dá)到平衡，終產(chǎn)物比例基本不變。而t，t-CLA的產(chǎn)量與c9，t11-CLA相比較低，當(dāng)細(xì)胞濃度為3×1010cfu/m L時產(chǎn)量就趨于平穩(wěn)。

圖4 細(xì)胞濃度對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響Fig.4 Effectof cellmass on the bioconversion of CLA

2.4 底物濃度對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響

在酶催化的反應(yīng)體系中，酶和底物是最基本的構(gòu)成因素。不同的底物濃度（即LA濃度）會直接影響酶催化轉(zhuǎn)化的反應(yīng)速度，從而影響對底物的轉(zhuǎn)化效果。如圖5所示，在底物濃度小于0.8mg/m L的范圍內(nèi)，細(xì)胞量充足，只有少數(shù)的細(xì)胞和底物作用生成中間產(chǎn)物，在這種情況下，增加底物的濃度，就會增加產(chǎn)物c9，t11-CLA的含量；當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?mg/m L時，底物濃度足夠大，所有的細(xì)胞都與底物結(jié)合反應(yīng)，體系中已經(jīng)沒有游離態(tài)的細(xì)胞，繼續(xù)增加底物濃度不能提高產(chǎn)物c9，t11-CLA的量，由于可能存在一定的底物抑制現(xiàn)象，c9，t11-CLA的含量略微有所下降，而t，t-CLA的底物抑制濃度與c9，t11-CLA有所不同，當(dāng)LA濃度為0.3mg/m L的時候就出現(xiàn)了底物抑制現(xiàn)象。

圖5 底物濃度對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響Fig.5 Effectof substrate concentration on the bioconversion of CLA

2.5 反應(yīng)緩沖液pH對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響

在微生物細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的反應(yīng)過程中，反應(yīng)體系的pH不但會影響酶蛋白的構(gòu)型和酶的穩(wěn)定性以及酶的活性中心必需基團(tuán)的解離狀態(tài)和底物的解離狀態(tài)，還會影響涉及氧化還原反應(yīng)的輔酶體系和反應(yīng)中氫的傳遞及電子的轉(zhuǎn)移。在最適pH條件下，酶催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)的活性最佳，轉(zhuǎn)化效果最好，高于或低于此pH時，酶的活性會下降。

從圖6可以看出，反應(yīng)體系pH在6.5左右時，植物乳桿菌ZS2058生物轉(zhuǎn)化CLA的產(chǎn)量最高，pH過低或過高都很大程度的影響了酶活，使產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率下降。因此，該反應(yīng)適合在中性環(huán)境中進(jìn)行。

圖6 反應(yīng)pH對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響Fig.6 Effect of pH value on the bioconversion of CLA

2.6 反應(yīng)溫度對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響

反應(yīng)溫度對酶催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響有兩個方面：一方面，隨著溫度升高，活化分子數(shù)增多，酶反應(yīng)速度加快；另一方面，隨著溫度升高，酶蛋白逐步變性失活，酶的活性隨之降低，減弱轉(zhuǎn)化效果。圖7結(jié)果表明，溫度在37℃左右時，較適合生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進(jìn)行，溫度過低或過高都很大程度的影響酶活，使產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率下降。

2.7 響應(yīng)面分析優(yōu)化生物轉(zhuǎn)化CLA的條件

圖7 反應(yīng)溫度對生物轉(zhuǎn)化CLA的影響Fig.7 Effect of temperature on the bioconversion of CLA

響應(yīng)面實驗設(shè)計的實驗結(jié)果見表2。15個實驗點可分為兩類，其一是析因點，自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點，共有12個析因點；其二是零點，為區(qū)域的中心點，零點實驗重復(fù)3次，用以估計實驗誤差。

表2 響應(yīng)面分析結(jié)果Table 2 The results of response surface analysis

以CLA產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，運用SAS-RSR（Response Surface Regression）程序?qū)?5個實驗點響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，經(jīng)回歸擬合后，得到如下回歸方程：

回歸方程及各項的方差分析如表3所示。

從方差分析表中可以看出，各因素中一次項X1、X2項是高度顯著的，二次項X12、X22項也是高度顯著，X1X2項是顯著的。因此，各具體實驗因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，回歸方程也是高度顯著的。相關(guān)系數(shù)R2=0.9725，說明響應(yīng)值（Y）有97.25%來源于所選變量的實驗范圍，即底物濃度、細(xì)胞濃度和pH。

從實驗所得的響應(yīng)面分析圖（圖8）上，能夠較為直觀地找出最佳條件及各因素在反應(yīng)中的相互作用。

對回歸方程中X1、X2、X3求偏導(dǎo)，計算得到生物轉(zhuǎn)化CLA的最優(yōu)條件為：底物濃度：0.85mg/m L；細(xì)胞濃度：4.13×1010cfu/m L；pH：6.74，得到理論CLA產(chǎn)量為：376.93μg/m L。所以考慮到實際操作的方便，結(jié)合方差分析表及響應(yīng)面分析圖，確定最佳轉(zhuǎn)化CLA的條件為：底物濃度：0.8mg/m L；細(xì)胞濃度：4×1010cfu/m L；pH：6.7。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

圖8 生物轉(zhuǎn)化CLA影響因素的RSA響應(yīng)面圖Fig.8 The chartof response surface analysis forCLA transformation condition

在此最佳因素組合的條件下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，優(yōu)水平組合條件下反應(yīng)產(chǎn)物的氣相色譜圖見圖9。利用峰面積歸一化法可以求得c9，t11-CLA、t10，c12-CLA和t，t-CLA的濃度分別為374.24、6.71、110.08μg/m L，與理論值相符，CLA總的轉(zhuǎn)化率為60.54%，其中c9，t11-CLA占總CLA含量的77.27%，轉(zhuǎn)化率為46.78%，比鈕曉燕等[9]報道的在20m L的反應(yīng)體系中的CLA轉(zhuǎn)化率提高了47.29%。

圖9 優(yōu)水平組合條件下反應(yīng)產(chǎn)物GC分析圖Fig.9 Gas chromatogram of products under the optimized reaction condition

3 結(jié)論

本文對L.plantarum ZS2058完整細(xì)胞在1m L磷酸鉀緩沖液反應(yīng)體系中的反應(yīng)條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，通過單因素實驗和響應(yīng)面分析，確定了最合適的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件，在此反應(yīng)條件下c9，t11-CLA的濃度為374.24μg/m L，轉(zhuǎn)化率高達(dá)46.78%。本文的研究工作將為最大限度地發(fā)揮酶催化反應(yīng)的高效率提供實驗依據(jù)，也為實現(xiàn)共軛亞油酸的高效生產(chǎn)和研究其生理功能提供借鑒。

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Study on condition optim ization of conjugated linoleic acid bioconversion by Lactobacillus plantarum ZS2058

CHEN Hai-qin，YANG Bo，XU Qing-yan，SONG Yuan-da，CHENW ei*，ZHANG Hao
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

The converted cond ition of LA to CLA by using Lactobacillus p lantarum ZS2058，which was screened from the Chinese traditional fermented vegetab le，was stud ied.Accord ing to the p roduction of CLA，bioconversion of CLA by resting cells of L.p lantarum ZS2058 in 1m L potassium phosphate buffer system was op tim ized.Through the sing le factor experiment and response surface analysis，374μg/m L of c9，t11-CLA was ob tained under the reaction cond ition as follows：0.8mg/m L LA solution，4×1010c fu/m L cell mass，op timal tem perature 37℃and the op timalpH value 6.7，and the conversion ratio of c9，t11-CLA was 46.78%，which was valuab le for p roducing CLA efficiently and studying its physiological function.

conjugated linoleic acid；bioconversion；Lac tobacillus p lantarum；conversion ratio

Q558

A

1002-0306（2012）22-0192-06

2012－07－20 *通訊聯(lián)系人

陳海琴（1978-），女，博士，副教授，主要從事食品生物技術(shù)方向的研究。

“十一五”國家“863計劃”（2007AA100402）；“十二五”國家“863計劃”（2011AA100905）。