釀酒酵母拮抗作用的蛋白組分析

沈海萍，樸永哲，祖國仁，夏先鋒，趙長新，*

（1.大連工業(yè)大學生物工程學院，遼寧大連 116034；

2.大連民族學院生命科學學院，遼寧大連 116600）

釀酒酵母拮抗作用的蛋白組分析

沈海萍1，樸永哲2，祖國仁1，夏先鋒1，趙長新1，*

（1.大連工業(yè)大學生物工程學院，遼寧大連 116034；

2.大連民族學院生命科學學院，遼寧大連 116600）

為研究混菌發(fā)酵過程中釀酒酵母胞外蛋白對克魯維酵母的拮抗作用并初步分離毒蛋白，采用超濾法提取釀酒酵母純培養(yǎng)及透析培養(yǎng)的胞外蛋白，分別加入克魯維酵母純培養(yǎng)液中，通過平板菌落計數(shù)法，動態(tài)觀測釀酒酵母胞外蛋白對克魯維酵母生長的影響；雙向電泳結(jié)合PDQuest軟件分離解析釀酒酵母兩種培養(yǎng)條件下的胞外蛋白圖譜。實驗結(jié)果表明，純培養(yǎng)下的釀酒酵母胞外蛋白對克魯維酵母無拮抗作用，而透析培養(yǎng)得到的釀酒酵母胞外蛋白可以導(dǎo)致克魯維酵母提前死亡；純培養(yǎng)圖譜共79個蛋白點；透析培養(yǎng)圖譜共109個蛋白點，比純培養(yǎng)的新增30個蛋白點。由此推斷：釀酒酵母可以分泌導(dǎo)致克魯維酵母提前死亡的分子量大于10ku的蛋白類毒素，并且這種毒素的分泌不是自發(fā)的，而是在克魯維酵母分子量小于10ku分泌物的誘導(dǎo)作用下才會產(chǎn)生。這30個新增蛋白點包括對克魯維酵母的拮抗蛋白。

酵母，胞外蛋白，拮抗作用，雙向電泳，透析培養(yǎng)

葡萄酒自然發(fā)酵是由兩類酵母，即釀酒酵母和非釀酒酵母共同完成的。在發(fā)酵初期，作為優(yōu)勢菌株的非釀酒酵母（如克魯維酵母）的生長，有助于酒體風味的形成，特別是甘油、酯類和高級醇等物質(zhì)的產(chǎn)生對酒的風味物質(zhì)形成有積極作用[1-2]。而隨著發(fā)酵的進行，非釀酒酵母逐漸死亡，具有高酒精耐受性的釀酒酵母成為優(yōu)勢菌株，完成后期酒精發(fā)酵[3]。因此，非釀酒酵母存活時間的長短對葡萄酒風味物質(zhì)的形成有著很大的影響。近年來，國際上有學者在實驗室條件下，觀測到在混菌發(fā)酵中釀酒酵母的存在導(dǎo)致非釀酒酵母的提前死亡的現(xiàn)象[4]，并嘗試解釋這一有趣的現(xiàn)象。傳統(tǒng)觀點認為釀酒酵母和非釀酒酵母的這種交替是由各菌種對外界不良環(huán)境的抵御能力上的差異導(dǎo)致的，比如酒精濃度的升高、有機酸的積累、pH顯著降低以及營養(yǎng)物質(zhì)的消耗等都可能導(dǎo)致非釀酒酵母的提前衰亡[5]。近年，這種觀點的通用性受到了質(zhì)疑，細胞間相互作用的理論逐漸成為研究熱點并被廣泛認可。這種相互作用包括兩方面：一些研究表明，酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物會抑制其他菌的生長，如中長鏈脂肪酸，一些有毒化合物如糖蛋白、多肽等，小分子量的信號分子等[6-7]；也有一些研究表明，釀酒酵母與非釀酒酵母間的交替作用是由于在高細胞濃度下細胞間爭奪生存空間造成的[8-9]。國際上，丹麥學者論證了混菌發(fā)酵中釀酒酵母CCMI 885蛋白類分泌物對幾種非釀酒酵母具有拮抗作用，并且用單項電泳分離出分子量在2～10ku的蛋白毒素[10]。國內(nèi)，翟明昌等[11]發(fā)現(xiàn)了釀酒酵母FFC2144的存在導(dǎo)致了克魯維酵母FCC2116的提前死亡，并排除空間爭奪、溶氧、酒精度、pH、氮源等因素，確定是釀酒酵母的分泌蛋白導(dǎo)致了克魯維酵母的提前死亡，并指出釀酒酵母大分子量分泌蛋白對克魯維酵母也具有拮抗作用；并采用雙向電泳方法研究了克魯維酵母非程序衰亡的胞內(nèi)蛋白組表征[12]。本實驗在前人研究的基礎(chǔ)上，通過雙向電泳技術(shù)，從蛋白組學層面進一步研究釀酒酵母分泌的哪些蛋白導(dǎo)致了克魯維酵母的提前死亡，并試圖揭示釀酒酵母產(chǎn)生抑菌蛋白的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae FFC2144）大連工業(yè)大學菌種保藏中心；耐熱克魯維酵母（K luyveromyces Thermotolerans FCC2116） 大連工業(yè)大學菌種保藏中心；培養(yǎng)基采用改良的全合成培養(yǎng)基（L）[13]40g葡萄糖，6g檸檬酸，6g DL-蘋果酸，1.5g酒石酸，6.7g YNB（Yeast nitrogen base without am ino acids，Difco），10g（NH4）2SO4，0.5g色氨酸，0.5g組氨酸，0.5g精氨酸，pH 3.3。

圓盤式電泳儀及垂直板電泳槽 北京六一廠；1L螺口瓶 紗布封口。

1.2 菌體培養(yǎng)

培養(yǎng)條件：28℃，搖床轉(zhuǎn)速100r/m in。

透析培養(yǎng)：將克魯維酵母接種于透析袋（截留分子量為10ku）的內(nèi)部，接種后袋內(nèi)共計15m L發(fā)酵液，釀酒酵母接種于透析袋的外部，接種后袋外共計485m L發(fā)酵液，接種濃度均為1×104cfu/m L。

1.3 菌體生長曲線測定

自接種時刻開始，每5h在無菌室取發(fā)酵液，稀釋涂平板（YPDA培養(yǎng)基[12]），培養(yǎng)12～24h，單菌落計數(shù)，并合算成該時間段的菌體濃度（cfu/m L）。

1.4 蛋白提取

根據(jù)釀酒酵母FFC2144菌體濃度（生長進入平衡期）、殘?zhí)荹14]（少于2g/L）及酵母細胞完整性，選擇發(fā)酵60h為釀酒酵母FFC2144胞外蛋白提取時間。

胞外蛋白提取方法-超濾法：發(fā)酵液于6000r/m in離心，得上清液。上清液用10ku的超濾膜冰浴濃縮，雙蒸水多次沖洗以去掉雜質(zhì)及小分子物質(zhì)，再通過反沖洗濾膜，將截留的大分子物質(zhì)沖洗下來。將蛋白濃縮液冷凍干燥，待用。

1.5 抑菌實驗

離心后的發(fā)酵上清液用超濾方法除去糖、酸、醇、酯等較小分子量物質(zhì)，并且通過冷凍干燥法將其體積從的150m L左右體積的溶液濃縮到約10m L，將得到的胞外蛋白濃縮液加入到剛剛接種的克魯維酵母FCC2116的純菌發(fā)酵液中，進行培養(yǎng)。動態(tài)觀測克魯維酵母的生長情況（即各時段菌體濃度）。

1.6 雙向電泳

樣品制備：在冰浴條件下，將凍干的蛋白溶解于適量的蛋白溶解液（8mol/L尿素，50mmol/L DTT，5% Triton×100，2.5%pH4～6兩性電解質(zhì)，0.5%pH3～10兩性電解質(zhì)）中，并輔助超聲及漩渦振蕩促進溶解。目測蛋白溶解后，于13000r/m in離心10m in，取上清液，用考馬斯亮藍法測定溶解液中蛋白濃度，添加新鮮溶解液，混勻，使各樣品蛋白終濃度為150μg/15μL（上樣量），并按上樣量分裝，冷凍保藏。上樣前樣品中加入微量溴酚藍指示劑，充分混勻。

膠條制作：在王祥余等[15]方法基礎(chǔ)上略加修改，注膠量不以體積計，而保證每根膠長度為7cm。

等電聚焦條件：200V 0.5h，500V 1h，1350V 4h；每次升高電壓時，按約200V/m in速度勻速緩慢提升電壓。

平衡條件：兩步平衡。平衡液1∶6mol/L尿素，2% SDS，100mmol/L Tris（pH 8.8），30%甘油，1%DTT，15min；平衡液2∶6mol/L尿素，2%SDS，100mmol/L Tris（pH 8.8），30%甘油，2%碘乙酰胺，15m in。

SDS-PAGE：5%的濃縮膠，12%分離膠。染色方法：Neuhoff考染法[16]。

1.7 凝膠圖像分析

凝膠通過BINTA 2020D型凝膠成像系統(tǒng)進行拍照，利用PDQuest 8.0軟件完成對凝膠圖像的剪裁、斑點檢測、匹配、差異比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 釀酒酵母胞外蛋白對克魯維酵母的影響

對圖1中三組關(guān)鍵差異數(shù)據(jù)進行整理分析，得表1（各組數(shù)據(jù)重復(fù)性標準偏差以±標注）。通過Excel數(shù)據(jù)分析，空白組和純培養(yǎng)胞外蛋白添加組的p為0.2316，而空白組比對透析蛋白添加的p為0.000813＜0.05，因此可以判斷：釀酒酵母FFC2144純培養(yǎng)的大分子量蛋白（大于10ku）的添加對克魯維酵母FCC2116生長影響不大，而透析培養(yǎng)得到的胞外蛋白對FCC2116有顯著影響。由此可以推斷，釀酒酵母FFC2144分泌出對魯維酵母生長具有拮抗作用的蛋白類物質(zhì)這一現(xiàn)象并非自發(fā)；即在透析培養(yǎng)中，克魯維酵母FCC2116產(chǎn)生一種小分子信號物質(zhì)，誘導(dǎo)釀酒酵母FFC2144分泌出特異蛋白。其中部分新增的特異蛋白（包含于2DE圖譜的總新增蛋白點中），最終導(dǎo)致了克魯維酵母的提前死亡。

圖1 不同條件下克魯維酵母生長曲線Fig.1 Curves of Kluyveromyces Thermotolerans concentration under different conditions

表1 不同條件下克魯維酵母數(shù)量的變化（lgcfu/mL）Table 1 Changes of Thermotolerans concentrationquantity under different conditions（lgcfu/mL）

2.2 純培養(yǎng)和透析培養(yǎng)的釀酒酵母胞外蛋白圖譜比較

通過PD Quest軟件，可對兩張雙向電泳圖譜進行蛋白點總數(shù)計算、同一蛋白點匹配以及差異蛋白分析（本實驗中僅對新增蛋白點進行定性分析，不進行蛋白含量的差異比較）。圖2a中，釀酒酵母FFC2144純培養(yǎng)胞外蛋白雙向電泳圖譜中共有79個點，主要分布在分子量大于40ku的酸性區(qū)域。圖2b中，從透析培養(yǎng)中提取的釀酒酵母FFC2144胞外蛋白雙向電泳圖譜中包含109個點，分布集中在分子量大于20ku的酸性和中性區(qū)域。比較圖2中a、b兩圖譜，發(fā)現(xiàn)透析培養(yǎng)蛋白圖譜上新增30個點，占純培養(yǎng)總蛋白種類的54%。變化如此巨大，反映了酵母蛋白分泌對環(huán)境的靈敏度，也體現(xiàn)了胞外蛋白分泌機制對酵母環(huán)境適應(yīng)性的重大意義。增加點多分布于pH 6～8區(qū)間，分子量在30ku以上。由2.1結(jié)果可推斷，這新增30個蛋白點中必包括對FCC2116的拮抗蛋白。

圖2 釀酒酵母兩種培養(yǎng)條件下胞外蛋白雙向電泳圖譜Fig.2 2DE images of Saccharomyces Cerevisiae extracellular proteins from the two cultures

3 結(jié)論

釀酒酵母可以分泌導(dǎo)致非釀酒酵母提前死亡的分子量大于10ku的蛋白類毒素（有別于國際上發(fā)現(xiàn)的酵母小分子量抑菌蛋白），并且這種毒素的分泌不是自發(fā)的，而是在非釀酒酵母分子量小于10ku分泌物的誘導(dǎo)作用下才會產(chǎn)生。釀酒酵母透析培養(yǎng)胞外蛋白圖譜比純培養(yǎng)圖譜新增30個蛋白點，其中包括對非釀酒酵母的毒蛋白。研究結(jié)果有望為釀酒酵母拮抗蛋白的相關(guān)詮釋作補充。

[1]Romano P，Suzzi G，Com I G，et al.Glycerol and other fermentation products of apiculate wine yeasts[J].Journal of Applied Microbiology，1997，82（6）：615-618.

[2]Eglic M，EDnger W D，Mitrakul C M，et al.Dynamics of indigenous and inoculated yeast populations and their effect on the sensory character of Riesling and Chardonnay wines[J]. Journal of Applied Microbiology，1998，85（12）：779-789.

[3]Clan IM，Picciott IG.The growth kinetics and fermentation behaviour of some non-Saccharomyces Cerevisiae yeasts association with wine-making[J].Biotechnology Letters，1995，17（11）：1247-1250.

[4]Nevado P F，Albergaria H，Hogg T，et al.Cellular death of two non-Saccharomyces Cerevisiaes wine-related yeasts during mixed fermentations with Saccharomyces Cerevisiae[J]. International Journal of Food Microbiology，2006，108（3）：336-345.

[5]Pretorus I S.Tiabring wine yeast for new millennium：novel approaches to the ancient art of winemaking[J].Yeast，2000，16（2）：675-729.

[6]Edwards C G，Beelman R B，Bartley C E，et al.Production of decanoic and other volatile compounds and the growth of yeast and malolactic bacteria during vinification[J].American Journal of Enology and Viticulture，1990，41（3）：48-56.

[7]FleetGH.Yeast interactions and wine flavour[J].International Journal of Food Microbiology，2003，86（9）：11-22.

[8]Nissen P，Nelsen D，Arnegorg N.Viable Saccharomyces Cerevisiae cells athigh concentrations caused early growth arrest of Non-Saccharomyces Cerevisiae mechanism[J].Yeast，2003，20（9）：331-341.

[9]Nissen P，Arneborg N.Characterization of early deaths of Non-Saccharomyces yeasts inmixed cultureswith Saccharomyces Cerevisiae[J].Archives of Microbiology，2003，180（7）：257-263.

[10]Albergaria H，F(xiàn)rancisco D，Gori K et al.Saccharomyces Cerevisiae CCMI 885 secretes peptides that inhibit the growth of some non-Saccharomyces wine-related strains[J].Applied Microbiology Biotechnology，2010，86（3）：965-972.

[11]翟明昌，樸永哲，王祥余，等.葡萄酒發(fā)酵過程中酵母菌之間相互抑制作用的研究[J].中國微生態(tài)學雜志，2011，23（1）：18-21.

[12]翟明昌，樸永哲，王祥余，等.混菌發(fā)酵中不同分子量代謝產(chǎn)物對非釀酒酵母胞內(nèi)蛋白及酒體有機酸的影響[J].微生物學通報，2011，38（9）：1443-1448.

[13]Nissen P，Arneborg N.Characterization of early deaths of non-Saccharomyces yeasts inmixed cultureswith Saccharomyces cerevisiae[J].Archives of Microbiology，2003，180（4）：257-263.

[14]黃潔，宋紀蓉，史紅兵，等.蘋果發(fā)酵液中殘余還原糖的測定方法比較[J].工業(yè)微生物，2011，31（3）：38-40.

[15]王祥余，樸永哲，翟明昌，等.釀酒酵母FFC2146胞內(nèi)蛋白及胞外蛋白雙向電泳條件優(yōu)化及圖譜建立[J].微生物學通報，2011，38（2）：270-274.

[16]Neuhoff V，Arold N，Taube D，et al.Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nano-gram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250[J].Electrophoresis，1988，9（6）：255-262.

Proteom ic analysis on the antagonism of Saccharom yces Cerevisiae

SHEN Hai-ping1，PIAO Yong-zhe2，ZU Guo-ren1，XIA Xian-feng1，ZHAO Chang-xin1，*
（1.School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China；
2.College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，China）

To study the antagonism of Saccharomyces Cerevisiae’s extracellular p roteins against Kluyveromyces Thermotolerans in the m ixed culture，and to p relim inarily separate the toxic p roteins，extracellular p roteins of Saccharomyces Cerevisiae from sing le culture and dialysis tube fermentation were extracted by ultrafiltration，added into the sing le culture of Kluyverom yces Thermotolerans respec tively，for further population dynam ic analysis of Kluyveromyces Thermotolerans under the influence of Saccharomyces Cerevisiae extracellular p roteins by p late countmethod.The extracellular p roteins of Saccharomyces Cerevisiae from the two cultures were seperated and analyzed using two-d imensional electrophoresis combined w ith PDQuest software. Statistics showed that extracellular p roteins of Saccharomyces Cerevisiae from sing le culture d isp layed no antagonistic action on Kluyverom yces Thermotolerans，while those extrac ted from the d ialysis tube fermentation induced the early death Kluyveromyces Thermotolerans.79 spots were detected on the sing le culture p rofile while 109 spots were found on the dialysis tube fermentation one.By com parison，30 new spots appeared on the d ialysis tube fermentation image.In conc lusion Saccharom yces Cerevisiae could secrete high molecular weight（＞10ku）p roteins that could be toxic to Kluyverom yces Thermotolerans.Moreover，the secretion of toxic p roteins was not spontaneous，but by the induction of secretion smaller than 10ku from non-Saccharomyces Cerevisiae.The antagonistic p roteins were inc luded w ithin the 30 new spots.

yeast；extracellular p roteins；antagonism；two-dimensionalelec trophoresis；dialysis tube fermentation

TS201.3

A

1002-0306（2012）22-0178-04

2012－05－08 *通訊聯(lián)系人

沈海萍（1986-），女，碩士研究生，研究方向：微生物學。