納米硒-殼聚糖復(fù)合物緩釋作用研究

吳永軍

（馬鞍山師范高等專科學(xué)校理工系，安徽馬鞍山 243041）

納米硒-殼聚糖復(fù)合物緩釋作用研究

吳永軍

（馬鞍山師范高等專科學(xué)校理工系，安徽馬鞍山 243041）

以鹽酸羥胺、亞硒酸為反應(yīng)物，食品級海藻酸鈉為軟模板，制備了分散性良好的紅色無定形納米硒。輔以殼聚糖、玉米淀粉，合成出了納米硒-殼聚糖復(fù)合顆粒，在模擬消化液中研究了復(fù)合物的硒緩釋行為，考察了模擬消化液pOH、緩釋溫度、緩釋時間對硒釋放率的影響。結(jié)果表明，含硒復(fù)合物適合于緩釋，最佳緩釋條件為：模擬消化液pOH= 12.80，緩釋溫度38℃，緩釋2.8h，納米硒-殼聚糖復(fù)合物的硒釋放率達(dá)到68.43%，實測結(jié)果與模型預(yù)測值的相對誤差僅為0.48%。

納米硒，殼聚糖，緩釋，響應(yīng)面分析

1817年，瑞典化學(xué)家Berzelius J J從硫酸工廠鉛室內(nèi)的沉積物中分離出硒元素。硒具有清除自由基、增強(qiáng)免疫、調(diào)節(jié)代謝、抗腫瘤、預(yù)防疾病等重要的生物學(xué)活性[1-5]。WHO于1973年宣布硒是人體必需的微量營養(yǎng)元素。1988年，中國營養(yǎng)學(xué)會也將硒列為15種每日膳食營養(yǎng)素之一。我國是缺硒大國，70%的國土面積缺硒[6]，數(shù)億人口生活在缺硒地區(qū)，成年人硒的日攝入量遠(yuǎn)低于推薦供給量[7]，因此大多數(shù)人需要補(bǔ)充硒元素，補(bǔ)硒制劑具有廣闊的市場前景。目前的硒源主要有：無機(jī)硒（硒酸鹽和亞硒酸鹽）、有機(jī)硒（硒蛋白、硒代氨基酸）、納米硒（α-Se、t-Se）。相比之下，無定形紅色納米硒（α-Se）具有突出的低毒高效性[8]，較之晶態(tài)納米硒（t-Se）更易于分散，溶解性能更好，是補(bǔ)硒強(qiáng)化劑的理想硒源。自1994年張勁松、高學(xué)云博士率先研制出納米硒之后，關(guān)于納米硒的應(yīng)用研究主要集中在光電子方面，鮮有利用納米硒開展補(bǔ)硒的研究。筆者已開展過利用納米硒進(jìn)行小白菜補(bǔ)硒的研究[9]。另一方面，殼聚糖（chitosan）具有良好的降解性、透過性，且安全無毒等眾多的優(yōu)點，是一種優(yōu)良的緩釋材料[10]，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等多學(xué)科領(lǐng)域。本研究利用自制的水溶性殼聚糖[11]合成納米硒-殼聚糖復(fù)合物并進(jìn)行硒緩釋作用的研究，希望對補(bǔ)硒制劑的開發(fā)與應(yīng)用提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SeO2、99.99%高純硒粉 西亞化工有限公司；鹽酸羥胺、25%戊二醛 國藥化學(xué)試劑有限公司；硝酸、鹽酸、氫氧化鈉、苯 均為AR，南京化學(xué)試劑有限公司；食品級海藻酸鈉、95%酒精、水溶性殼聚糖[10]、玉米淀粉（一級） 南京雨潤；去離子水、蒸餾水。

日立Hitachi S-4800型掃描電鏡 日本；Y-4Q型X射線衍射儀 丹東射線儀器廠；DZF型真空干燥箱金壇漢康電子有限公司；PS-10AL型超聲清洗儀 上海之信儀器有限公司；HHS-21-4型恒溫水浴鍋、79-1型磁力攪拌器 金壇新航儀器廠；TGL-16C型離心機(jī) 常州中捷實驗儀器有限公司；FA1104型分析天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 納米硒的制備 稱量2.774g SeO2和0.250g海藻酸鈉，分別用蒸餾水定容至500m L，配制0.05mol/L的H2SeO3溶液和0.5g/L的海藻酸鈉溶液。移取20m L 25%戊二醛溶液，以蒸餾水定容至100m L，配制成5%戊二醛溶液，用于下述實驗。

移取20m L 0.1mol/L的NH2OH·HCl溶液注入一只干燥清潔的250m L燒杯中，加入一定量的0.5g/L海藻酸鈉溶液后搖勻，用移液管加入10m L 0.05mol/L的H2SeO3溶液，n（NH2OH·HCl）∶n（H2SeO3）=4∶1，以鹽酸羥胺還原亞硒酸，海藻酸鈉大分子充當(dāng)軟模板分散控制硒納米晶生長，快速搖勻后置于恒溫水浴鍋中分別于50、80℃下加熱1h，制得納米硒產(chǎn)物。

1.2.2 納米硒-殼聚糖復(fù)合物的制備 按1.2.1實驗方法，先制備紅色α-Se。產(chǎn)物經(jīng)去離子水清洗一次，靜置后倒去紅色沉淀上方清液。隨后，加入100m L蒸餾水、10.0g殼聚糖作為緩釋劑、2.0g玉米淀粉作為粘結(jié)劑、崩解劑。以500r/m in的轉(zhuǎn)速磁力攪拌1h后形成均一穩(wěn)定的淺紅色懸濁液，再加入5m L 2%戊二醛溶液，繼續(xù)攪拌10m in后將混合液倒入藥粒模具內(nèi)，置于冰箱冷凍室中，-4℃下冷凍5h后制得40粒淺紅色藥粒。藥粒取出后用純凈水快速沖洗1遍，40℃下真空干燥2h，最后獲得淺紅色含硒藥粒成品。

1.2.3 緩釋研究 將濃鹽酸稀釋后輔以氫氧化鈉配制一定酸度（以pOH表示）的模擬消化液500m L。將一顆含硒藥粒投入裝有500m L模擬消化液的燒杯中，置于恒溫水浴里，通過一定時間內(nèi)硒含量測定來折算釋放率，研究其緩釋行為?？疾觳煌琾OH消化液、緩釋時間、溫度對納米硒-殼聚糖復(fù)合物緩釋作用的影響。測量模擬緩釋液中硒含量時，每次取1m L緩釋液，以鄰苯二胺紫外分光光度法[11]測定其中硒的紫外吸收，同時補(bǔ)充1m L同溫度下的同pOH空白液回緩釋體系。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 標(biāo)準(zhǔn)硒液配制：稱取高純硒粉0.0200g，以10%稀硝酸溶解、定容至100m L，從中吸取10.00m L，定容至1000m L，獲得濃度為2μg/m L的標(biāo)準(zhǔn)硒液。分別吸取硒標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00m L置于分液漏斗中，折合含硒量為2、4、6、8、10、12μg。以鄰苯二胺紫外分光光度法[12]測定樣本吸光度，硒標(biāo)液在200～400nm波長范圍內(nèi)掃描，335nm處存在最大吸收峰。故而以紫外分光光度計在335nm波長下測樣品吸光度A，以未加入復(fù)合緩釋物的模擬消化液為空白對照，繪制出標(biāo)準(zhǔn)硒曲線。以吸光度對硒含量進(jìn)行回歸，解算回歸方程。

1.2.5 樣品硒含量與硒釋放率 采集不同實驗條件下的緩釋液樣本，置于分液漏斗中，按1.2.4中方法，以空白模擬消化液的苯萃取液為參照，分別測定樣本的吸光度，利用回歸方程解算含硒量，進(jìn)而折算硒

釋放率，如式（1）所示。

1.2.6 單因素實驗 通過前期研究，發(fā)現(xiàn)影響復(fù)合緩釋物硒釋放率的主要影響因素有：模擬消化液pOH、緩釋溫度、緩釋時間。這三者作為考察因素，以硒釋放率作為評價指標(biāo)，進(jìn)行單因素實驗。

1.2.6.1 模擬消化液的pOH對復(fù)合物緩釋作用的影響 將裝有模擬消化液的燒杯放入37℃恒溫水浴中，緩釋時間為1h時，考察納米硒-殼聚糖復(fù)合物在不同pOH的模擬消化液中的釋放效果。由于人體胃液中消化液的pH約為1.2，小腸消化液的pH約為6.8，其他體液（血液、淋巴等）則偏堿性，故而選用緩釋液的pH范圍：1.2～12.4（以胃液pH為酸度上限），對應(yīng)的pOH范圍為：1.6～12.8。

1.2.6.2 緩釋溫度對復(fù)合物緩釋作用的影響 當(dāng)模擬消化液pOH為12.8、緩釋時間為1h時，將緩釋體系置于恒溫水浴中，考察納米硒-殼聚糖復(fù)合物在不同溫度（30～55℃）的模擬消化液中的釋放效果。

1.2.6.3 緩釋時間對復(fù)合物緩釋作用的影響 當(dāng)模擬消化液pOH為12.8、水浴溫度為37℃時，考察納米硒-殼聚糖復(fù)合物浸沒于模擬消化液不同時間（0.5～ 7h）后的釋放效果。

1.2.7 中心組合實驗設(shè)計 根據(jù)Box-Benhnken實驗原理，結(jié)合上述單因素實驗結(jié)果，以模擬緩釋液pOH值（A）、緩釋溫度（B）、緩釋時間（C）這3個因素構(gòu)建響應(yīng)面實驗，因素水平如表1所示。

表1 納米硒-殼聚糖復(fù)合物緩釋作用響應(yīng)面分析試驗設(shè)計因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 納米硒的表征

按1.2.1實驗方法制得高分散性產(chǎn)物經(jīng)SEM檢測，如圖1、圖2所示。

圖1 50℃產(chǎn)物的SEM（80000×）Fig.1 SEM image of the products synthesized under 50℃（80000×）

圖2 80℃產(chǎn)物的SEM（40000×）Fig.2 SEM image of the products synthesized under 80℃（40000×）

將該反應(yīng)產(chǎn)物依次經(jīng)由去離子水、工業(yè)酒精各超聲清洗2遍，自然干燥后制成納米粉體，在10°≤2θ≤80°范圍內(nèi)用X射線衍射表征，產(chǎn)物的XRD如圖3、圖4所示。衍射數(shù)據(jù)經(jīng)與JCPDS卡對比，發(fā)現(xiàn)80℃下獲得是三方相晶態(tài)的t-Se（灰褐色），50℃下獲得是非晶的α-Se（紅色）。由于紅色α-Se具有廣泛的生物活性，溶解性良好[13]，因此選擇其作為硒源制備納米硒復(fù)合物，開展緩釋實驗。

圖3 50℃產(chǎn)物的XRDFig.3 XRD image of the products synthesized under 50℃

圖4 80℃產(chǎn)物的XRDFig.4 XRD image of the products synthesized under 80℃

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of Selenium

由1.2.4步驟中測算出6個不同樣本在335nm下的吸光度，顯示樣本線性良好，如圖5所示。推算出吸光度A對緩釋樣本硒濃度的回歸方程A=0.0148C-0.0323（N=6），r2=0.9941，線性范圍：2～12μg。

2.3 單因素實驗

2.3.1 模擬消化液的pOH對復(fù)合物緩釋作用的影響單因素實驗結(jié)果如圖6所示。隨著模擬消化液pOH的上升，模擬液中的硒含量逐漸增大，pOH大于10以后，硒釋放率增長緩慢。以上實驗現(xiàn)象可以通過溶液pH對復(fù)合物基質(zhì)的影響加以解釋。楊明世等[14]研究表明，酸性環(huán)境有助于玉米淀粉的崩解速度的提高；邵麗等[15]報道了殼聚糖緩釋微球在pH＜7.4溶液中的釋放速度明顯大于堿性溶液，且釋放速度與溶液的酸度呈正相關(guān)?？梢?，模擬消化液酸性增加，有助于其中的緩釋劑與崩解劑的崩解釋放，進(jìn)而提高復(fù)合物中硒的釋放率。由以上實驗結(jié)果，將模擬消化液的pH設(shè)定為1.2～6.8，對應(yīng)的pOH為7.2～12.8。

圖6 模擬消化液pOH對復(fù)合物緩釋作用的影響Fig.6 Effect of the pOH of simulation digestive juice on the sustained-release profile of complex

2.3.2 緩釋溫度對復(fù)合物緩釋作用的影響 單因素實驗結(jié)果如圖7所示。30～50℃范圍內(nèi)隨著模擬消化液溫度的上升，緩釋體系中含硒量不斷上升，但達(dá)到40℃以上時，增速減?。怀^50℃后，含硒量開始逐漸降低。李德海等[16]通過研究發(fā)現(xiàn)，溫度上升會加速玉米淀粉的糊化。出現(xiàn)圖7所示這種現(xiàn)象的原因在于作為控釋劑的殼聚糖與作為崩解劑的玉米淀粉在升溫后逐漸糊化[17]，糊化物難溶于水，其包裹在納米硒-殼聚糖復(fù)合物表面，抑制了納米硒的釋放。由以上實驗結(jié)果，參考人體正常的溫度范圍，設(shè)定緩釋溫度為35～39℃。

圖7 緩釋溫度對復(fù)合物緩釋作用的影響Fig.7 Effectof the sustained-release temperature on the sustained-release profile of complex

2.3.3 緩釋時間對復(fù)合物緩釋作用的影響 當(dāng)模擬消化液pOH為12.8、水浴溫度為37℃時，考察納米硒-殼聚糖復(fù)合物浸沒于模擬消化液不同時間（0.5～7h）后的釋放效果。實驗結(jié)果如圖8所示?？梢姡S著緩釋時間的延長，緩釋體系中硒的釋放率逐漸上升，但增速逐漸減小。釋放過程存在明顯的突釋（＜3h）與緩釋（＞3h）兩個時期，其釋放機(jī)理大致為：復(fù)合緩釋物投入水中后，顆粒外表面吸水，殼聚糖與玉米淀粉開始溶脹，短時間內(nèi)大量納米硒通過破裂的外壁釋放出來，此過程為突釋期；此后，外層的殼聚糖溶脹后糊化包裹在復(fù)合緩釋顆粒的外層，內(nèi)部的納米硒必須通過緩慢的擴(kuò)散才能突破表面糊化層而釋放出來，極大降低了硒的釋放速率。同時，溶液中已經(jīng)存在的納米硒會抑制復(fù)合緩釋顆粒中納米硒的繼續(xù)釋放[18]。兩種效應(yīng)疊加起來，促成了“緩釋期”。依據(jù)上述實驗事實，參考混合食物在胃部的停留時間，設(shè)定緩釋時間為2～4h，用于以下分析。

圖8 緩釋時間對復(fù)合物緩釋作用的影響Fig.8 Effectof the sustained-release time on thesustained-release profile of complex

2.4 利用響應(yīng)面分析法確定最優(yōu)緩釋條件

2.4.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果如表2所示，其中1～5號是中心實驗，6～17號為析因?qū)嶒?，中心實驗重?fù)5次以評估實驗誤差。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計方案及實驗結(jié)果Table 2 Experimental design and results of the Box-Benhnken test

2.4.2 建立擬合模型與方差分析 對表2中3個影響因素A、B、C的數(shù)值及硒的釋放率利用Design Expert 7.1.6軟件進(jìn)行回歸分析，得出回歸方程及方差分析

表，詳見式（2）、表3。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 ANOVA for the regressionmodel

由表3可知：回歸方程的顯著性相當(dāng)明顯，A、B、C、BC、A2、B2、C2極顯著，AC顯著，AB不顯著，分析結(jié)果表明，上述影響因素對復(fù)合緩釋物中硒釋放率具有不同的交互影響作用?；貧w方程的R2=0.9926，模型與實際實驗具有良好的擬合性，實驗中失擬項較小，回歸方程滿足實驗分析要求。

2.4.3 響應(yīng)面分析 分別將模擬緩釋液pOH、緩釋溫度、緩釋時間三個因素兩兩為自變量，以硒釋放率為響應(yīng)指標(biāo)做出響應(yīng)面，考察各因素間的交互作用對納米硒復(fù)合物釋放率的影響，如圖9～圖11所示。其中，緩釋溫度與緩釋時間的交互作用對復(fù)合物硒釋放率的影響（圖11）極為顯著（p＜0.01），其響應(yīng)面曲線較陡；模擬緩釋液pOH與緩釋時間之間交互作用（圖10）顯著（p＜0.05）；模擬緩釋液pOH與緩釋溫度之間交互作用（圖9）不顯著（p＞0.05）、曲線較為平滑。

圖9 模擬消化液p OH和緩釋溫度的交互作用對硒釋放率影響的響應(yīng)面Fig.9 Response surface plot of the pOH of simulation digestive juice and the sustained-release temperature on the yield

圖9是模擬消化液pOH和緩釋溫度交互影響復(fù)合緩釋物硒釋放率的響應(yīng)面。由圖9可見，當(dāng)模擬消化液pOH不變時，隨緩釋溫度的升高，硒釋放率先增加后小幅減小，在38℃左右硒的釋放率達(dá)到最大；緩釋溫度不變，硒釋放率隨模擬消化液pOH增大而呈小幅上升趨勢，響應(yīng)曲面比較平滑，增大pOH，有助于提高復(fù)合物的硒釋放率。

圖10 模擬消化液pOH值和緩釋時間的交互作用對硒釋放率影響的響應(yīng)面Fig.10 Response surface plotof the pOH of simulation digestive juice and the sustained-release time on the yield

圖10是模擬消化液pOH與緩釋時間交互影響復(fù)合緩釋物硒釋放率的響應(yīng)面。由圖10可見，當(dāng)模擬消化液pOH不變時，隨緩釋時間的延長，納米硒-殼聚糖復(fù)合物的硒釋放率先逐漸增大，接近3h時釋放率最大；緩釋時間不變，隨著模擬消化液pOH增大，復(fù)合物的硒釋放率明顯增大，響應(yīng)面陡峭，pOH=12.8（pH=1.2，相當(dāng)于胃液pH）時達(dá)到最大釋放率。

圖11 緩釋溫度和緩釋時間的交互作用對硒釋放率影響的響應(yīng)面Fig.11 Response surface plotof the slow-release temperature and the sustained-release time on the yield

圖11是緩釋溫度與緩釋時間交互影響復(fù)合物硒釋放率的響應(yīng)面。由圖11可見，緩釋溫度不變，隨緩釋時間的延長，納米硒-殼聚糖復(fù)合物的硒釋放率逐漸增大，增幅逐漸減??；緩釋時間不變，復(fù)合物的硒釋放率隨緩釋溫度的增大，先快速增大之后緩慢減小，響應(yīng)曲面比較陡。最大釋放率出現(xiàn)在3h多一點。實驗表明，緩釋溫度與緩釋時間這兩個因素交互作用顯著，與模型的方差分析結(jié)果一致。

通過Design Expert 7.1.6對擬合模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，獲得納米硒-殼聚糖復(fù)合物的最優(yōu)緩釋條件：模擬消化液pOH=12.8（pH=1.2），緩釋溫度38.17℃，緩釋2.84h，納米硒-殼聚糖緩釋復(fù)合物的硒釋放率可達(dá)到68.76%。鑒于實際操作的可行性，將實驗條件修正為：模擬消化液pOH=12.8（pH=1.2），緩釋溫度38℃，緩釋2.8h。使用以上條件重復(fù)3次平行實驗，計算平均硒釋放率為68.43%，與模型預(yù)測值的相對誤差為0.48%，說明本研究通過響應(yīng)面法獲得的緩釋條件是準(zhǔn)確可靠的。

3 結(jié)論

本研究利用鹽酸羥胺還原二氧化硒，以食品級海藻酸鈉為軟模板，低溫水浴快速制備粒徑小、高分散的無定形態(tài)納米級α-Se；以此作為安全硒源，添加在殼聚糖、玉米淀粉中制備出了納米硒-殼聚糖緩釋復(fù)合物。通過體外模擬人體緩釋實驗，考察了模擬消化液pOH、緩釋溫度、時間等因素對復(fù)合物緩釋作用的影響，初步探討了其釋放機(jī)理，借助響應(yīng)面分析法獲得了納米硒-殼聚糖復(fù)合物在模擬消化環(huán)境中的最優(yōu)緩釋條件。由于在復(fù)合緩釋物制備過程中清洗、脫模等工序會造成的納米硒損失，以及模擬人體中的消化緩釋環(huán)境的制約，所以硒釋放率的峰值無法達(dá)到100%，研究中響應(yīng)面分析也證實了這一結(jié)果。

整個實驗設(shè)計簡單、原料易得、三廢污染少、經(jīng)濟(jì)性高，產(chǎn)品具有突出的低毒、高效性。由于人體的消化是一個非常復(fù)雜的過程，納米硒-殼聚糖緩釋復(fù)合物在人體中的實際釋放行為會與本模型存在一定的差異，但以上研究表明，納米硒-殼聚糖復(fù)合物在整個藥效期內(nèi)釋放量比較平穩(wěn)，突釋短、緩釋長，其可作為一種新型的補(bǔ)硒緩釋制劑，在食品、醫(yī)療、保健等研究領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Study on the sustained-release profile of nano selenium chitosan com posite

WU Yong-Jun
（Science&Technology Department，Maanshan Teacher’s College，Maanshan 243041，China）

High scattered red amorphous nano selenium was synthesized in the p resence of food-grade sodium alginate，emp loying SeO2and NH2OH·HCl as the reactants.Then Nano selenium/chitosan com posite partic les were synthesized by com pound ing Nano selenium w ith chitosan and corn starch.The selenium sustainedrelease behavior of comp lex had been studied in simulation digestive juice，some fac tors influencing the release rate of selenium were systematically investigated，such as the pOH of simulation d igestive juice，the sustained-release temperature and time.Experiments showed that Nano selenium com p lex was fit for slowrelease.The op timal sustained-release conditions as follows：the pOH of simulation digestive juice was 12.8，sustained-release temperature was 38℃，sustained-release time was 2.8h.Under the cond ition，the release rate of selenium was up to 68.43%.The analysis capability of model was significant as the relative error between experimental resultand modelp red icted value was 0.48%.

nano selenium；chitosan；sustained-release；response surface analysis

TS202.3

A

1002-0306（2012）20-0141-05

2011－12－03

吳永軍（1978-），男，碩士，副教授，研究方向：功能材料、食品工程。

2010年安徽省高校省級自然科學(xué)研究項目（KJ2010B221）。