衍生化法測定水果中還原型谷胱甘肽（GSH）和總巰基含量

樸玉蓮，沈 麗，韓 玲，崔勝云

（延邊大學，長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室，吉林延吉 133002)

衍生化法測定水果中還原型谷胱甘肽（GSH）和總巰基含量

樸玉蓮，沈 麗，韓 玲，崔勝云*

（延邊大學，長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室，吉林延吉 133002)

用衍生化試劑5，5－二硫硝基苯甲酸（DTNB）對巰基化合物的衍生化反應和鄰苯二甲醛（OPA）與GSH的熒光衍生化反應，分別采用UV－vis分光光度法和熒光光度法測定了獼猴桃、大棗、酸漿中總巰基含量和GSH的含量。被測樣品中GSH和總巰基相對含量分布有較大的差異，其中獼猴桃和大棗中含有相對較高的GSH濃度分布，分別達0.7092、0.8374mol/g，酸漿中含有較高的總巰基含量分布，達1.4173mol/g。本測定方法的回收率達95.38%～101.9%，滿足測定準確度的要求，總巰基含量和GSH含量測定最低檢測限分別為9.6×10－7、2.69×10－7mol/L。

谷胱甘肽，巰基化合物，衍生化，5，5－二硫雙－2－硝基苯甲酸，鄰苯二甲醛

近年來，利用特有水果中的活性成分治療糖尿病、肥胖癥、代謝綜合癥等疾病受到人們的關注，這是因為某些水果中含特有的生物活性物質(zhì)[1]。迄今，水果中活性成分研究主要涉及各類維生素、礦質(zhì)元素、蛋白質(zhì)、氨基酸和多酚類、活性糖類等[2－6]，但鮮見植物體內(nèi)廣泛分布的GSH和含巰基化合物含量的報道。眾所周知，植物體內(nèi)GSH、半胱氨酸、植物螯合素（PCs）、金屬硫蛋白等含巰基化合物不僅在植物自身生理中扮演至關重要的角色，而且也對其他生命體提供類似的生物活性，如抗氧化、抗癌、延緩衰老等[7－12]。縱觀植物樣品活性成分的測定，其樣品處理過程大多經(jīng)過細胞破壁、提取、分離、衍生化等分析前處理。由于GSH等巰基化合物的巰基具有還原性且其肽鍵也能發(fā)生水解作用，故在樣品前處理中相對苛刻的化學環(huán)境及氧化還原態(tài)的影響會導致其巰基氧化變性或肽鍵水解斷裂，無法得到完整的GSH和巰基化合物的含量信息。這是目前許多植物樣品還缺少GSH和巰基化合物含量信息的原因之一。本研究分別采用DTNB和OPA作為衍生化試劑，利用細胞破壁、衍生化為一體的樣品前處理方法，用UV－vis分光光度法和熒光光譜法分別測定了獼猴桃、大棗、酸漿中總巰基含量和GSH的含量。本研究結(jié)果對GSH和巰基化合物含量信息及其活性地位、測定方法學研究提供了重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

還原型谷胱甘肽 Aldrich公司；半胱氨酸 Appli Chem公司；同型半胱氨酸 Sigma公司；5，5－二硫雙－2－硝基苯甲酸（DTNB） 沃凱試劑公司；鄰苯二甲醛

國藥化學試劑公司；其他試劑 均為分析純，實驗用水 三次蒸餾水；水果樣品 市售鮮品，其中野獼猴桃和酸漿為長白山區(qū)新鮮采摘品，大棗為山東產(chǎn)，獼猴桃為新西蘭產(chǎn)。

RF－5301PC熒光分光光度儀 日本島津公司；UV－8500紫外分光光度儀 天美公司；KQ－500DE數(shù)控超聲波清洗器，UP－400S超聲波細胞粉碎機，Mini－10K微型離心機，AP－220ZN空氣泵，pHS－3C實驗室酸度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 分析原理 利用衍生化試劑5，5－二硫雙－2－硝基苯甲酸（DTNB）與巰基化合物、小分子巰基化合物和含巰基蛋白質(zhì)發(fā)生衍生化作用，皆生成在可見光區(qū)內(nèi)具有較強吸收的5－硫代－2－硝基苯甲酸（TNBA）鹽黃色陰離子，故利用分光光度法可測定總巰基含量[13－15]。利用OPA衍生化試劑與GSH選擇性衍生化作用生成三環(huán)熒光衍生化產(chǎn)物，用熒光分光光度法測定GSH含量[16]。利用含衍生化試劑的緩沖液作為提取液，采用細胞破壁、衍生化為一體的前處理方法，其衍生化反應原理見圖1。

圖1 巰基化合物與DTNB和OPA的衍生化反應Fig.1 Derivatizing reactions of slfhydryl compounds with DTNB and OPA

1.2.2 樣品前處理 分別取市售新鮮獼猴桃、野獼猴桃、酸漿、大棗，洗凈，去皮，瀝干。分別取瀝干后的樣品1.0g移入50mL具塞錐瓶中，分別加入20mL含過量DTNB（2×10－4mol/L）和OPA（1×10－4mol/L）衍生化試劑的0.02mol/L PBS緩沖溶液，用超聲細胞粉碎機破壁5min，超聲波清洗儀振蕩40min，抽濾，取上清液。取10mL上清液，加入2倍體積乙醇，放置30min，在8000r/min離心除蛋白5min，取上清液作為光譜測定供試品。測定時取1mL樣品加入PBS緩沖液定容至10mL作為測試液。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理和畫圖及回歸分析是使用Origin數(shù)理統(tǒng)計和畫圖軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 巰基化合物衍生化反應光譜測定

DTNB與半胱氨酸和具有半胱氨酸殘基的多肽及蛋白質(zhì)的衍生化反應時無選擇性，皆生成TNBA黃色離子[17]。為了探討本實驗條件下巰基化合物與DTNB衍生化反應的選擇性，分別選擇還原型谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸（CySH）、同型半胱氨酸（HCySH）三種含巰基化合物，加入衍生化試劑OPA和DTNB，在PBS緩沖溶液中測定了熒光光譜和UV－vis吸收光譜，結(jié)果見圖2。

圖2 巰基化合物與OPA和DTNB混合溶液的熒光光譜圖和UV－vis吸收光譜圖Fig.2 Fluorescent and UV－vis spectra for the mixsture solutions of OPA and DTNB with sulfhydryl compounds

圖2－A的結(jié)果表明，只有GSH和OPA作用生成熒光衍生化產(chǎn)物并在激發(fā)波長為350nm時，在427nm處發(fā)出靈敏的熒光發(fā)射，而CySH和HCySH不與OPA生成熒光衍生化產(chǎn)物。圖2－B、C、D的結(jié)果表明，GSH和CySH與DTNB發(fā)生明顯的衍生化反應并在λmax=417nm處出現(xiàn)強度幾近相同的吸收峰（吸光度分別為0.1565和0.1583），說明等量的GSH和CySH生成相同量的衍生化產(chǎn)物TNBA，而HCySH不出現(xiàn)衍生化作用生成的新的吸收峰。由于HCySH比起CySH在旁鏈巰基（－SH）前包含一個額外的亞甲基，這使巰基更接近羧基并發(fā)生分子內(nèi)縮合形成高半胱氨酸硫內(nèi)酯導致無法發(fā)生衍生化作用。圖2的結(jié)果說明，DTNB對半胱氨酸及GSH中半胱氨酸殘基中巰基衍生化反應無選擇性，而OPA只與GSH發(fā)生選擇性衍生化作用。因此，利用DTNB衍生化試劑可測定包括GSH、CySH和含半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)的總巰基含量，利用OPA衍生化試劑可選擇性測定GSH含量。

2.2 OPA衍生化法測定樣品中GSH含量

利用OPA衍生化試劑，在測定熒光發(fā)射強度篩選10余種水果和藥用植物的基礎上，選擇獼猴桃、野獼猴桃、大棗、酸漿作為樣品，利用熒光光度法測定了它們GSH的含量。圖3為標準加入法測定得到的熒光發(fā)射光譜圖。

圖3 OPA樣品提取液及提取液中加入GSH標準溶液后的熒光光譜圖Fig.3 Fluorescent spectra for the OPA sample extracts before and after additon of GSH sdandard solutions

圖3結(jié)果表明，獼猴桃、野獼猴桃、大棗、酸漿的OPA提取液在λmax=427nm處出現(xiàn)明顯的熒光發(fā)射。當在該提取液中加入標準系列的GSH溶液時，熒光發(fā)射強度與加入的GSH的濃度呈良好的線性關系，其線性回歸方程及相關系數(shù)（r）依次為：I=14.735+ 13.152C（r=0.9992），I=13.183+14.602C（r=0.9997），I= 18.646+12.628C（r=0.9995），I=10.365+17.185C（r= 0.9997）。根據(jù)文獻[18]的方法分別測定了檢測限。獼猴桃、野獼猴桃、大棗、酸漿的GSH測定檢測限分別為2.69×10－7、3.37×10－7、3.44×10－7、2.97×10－7mol/L。用標準加入法測定樣品中GSH的含量，結(jié)果見表1。

表1 樣品中GSH的含量測定結(jié)果Table 1 Determination results of GSH in the sample

2.3 DTNB衍生化法測定總巰基含量

利用DTNB作為衍生化試劑，采用標準加入法測定了獼猴桃、野獼猴桃、大棗、酸漿中總巰基含量。DTNB的提取液和該提取液中加入標準系列的GSH溶液后的UV－vis吸收光譜圖見圖4。

圖4結(jié)果表明，獼猴桃、野獼猴桃、大棗、酸漿提取液在λmax=417nm處具有明顯的吸收。當加入標準系列GSH溶液后其吸收強度與加入的GSH濃度呈良好的線性關系，對應的線性回歸方程及相關系數(shù)分別為：A=0.0306+0.0224C（r=0.9984），A=0.0282+0.0236C（r=0.9988），A=0.0658+0.0328C（r=0.9991），A=0.0498+ 0.0215C（r=0.9982），檢測限依次為9.7×10－7、1.98×10－6、7.20×10－5、4.71×10－6mol/L。利用標準加入法測定了樣品中總巰基含量，結(jié)果見表2。

2.4 討論與分析

從表1、表2的測定結(jié)果比較中發(fā)現(xiàn)，不同的樣品其巰基化合物存在狀態(tài)有很大的不同。根據(jù)測定結(jié)果繪制了不同樣品的GSH、總巰基、總巰基與GSH含量差值分布圖，結(jié)果見圖5。

如圖5所示，總巰基含量高低順序依次為；酸漿＞大棗＞獼猴桃＞野獼猴桃。獼猴桃、大棗具有相對較高的GSH濃度分布，而酸漿中非GSH的巰基化合物含量分布較高。通過干擾實驗發(fā)現(xiàn)10倍的維生素C、谷氨酸、精氨酸、半胱氨酸對GSH的測定無明顯的干擾，但甘氨酸對OPA與GSH衍生化產(chǎn)物的測定具有明顯的干擾使其測定結(jié)果偏低。

圖4 DTNB樣品提取液及該提取液中加入GSH標準溶液后的UV－vis吸收光譜圖Fig.4 DTNB sample extracts before and after the addition of GSH sdandard solutions

圖5 樣品中各種巰基化合物含量分布圖Fig.5 Distribution graph of different thiol compounds

從實驗結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)，樣品前處理過程中衍生化反應順序?qū)値€基含量測定具有重要的影響。因為，利用含DTNB衍生化試劑的PBS緩沖液對樣品進行超聲破壁、除蛋白后得到的樣品測定結(jié)果與先用緩沖液超聲破壁、除蛋白、再經(jīng)衍生化得到的樣品測定結(jié)果進行比較，發(fā)現(xiàn)前者分析信號（吸光度）明顯大于后者。這一結(jié)果說明，細胞內(nèi)存在含半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)成分且該蛋白質(zhì)中的巰基也可與DTNB作用生成有色的TNBA衍生化產(chǎn)物離子。因此，本實驗采用含衍生化試劑的緩沖液進行破壁、提取，再經(jīng)去蛋白的樣品前處理方法，可準確測定樣品中包括含巰基蛋白在內(nèi)的總巰基含量。

3 結(jié)論

3.1 獼猴桃、大棗、酸漿中含豐富的GSH等含巰基化合物。其中酸漿和大棗不僅含豐富GSH外還含有豐富的其他巰基化合物，獼猴桃中含豐富的GSH含量。上述樣品所具有的抗氧化等生物學功能與其含有豐富的巰基化合物有關。

3.2 DTNB對GSH、CySH和含半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)無選擇性。由于該分析方法是基于測定衍生化產(chǎn)物TNBA的吸收強度作為分析信號，因此通過含衍生化試劑的提取液與細胞破壁和衍生化為一體的樣品處理模式，可不受除蛋白的影響而測定包括含巰基蛋白在內(nèi)的總巰基含量。

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Reduced glutathione（GSH）and total thiol detection in some fruits by derivatizing methods

PIAO Yu-lian，SHEN Li，HAN Ling，CUI Sheng-yun*
（Key Laboratory of Natural Resources of Changbai Mountain＆Functinal Molecules，Ministry of Education Yanbian University，Yanji 133002，China）

Total thiol and reduced glutathione in Kiwi，Jujube and Fruit Physalis had been determined by UV-vis spectrometry and fluorescent spectrometry using 5，5-dithio-bis-nitrobenzoic acid（DTNB）and O-phthaldehde（OPA）as derivatizing agents.Relative amount between total thiol and GSH varies significantly，among which kiwi and jujube contained relative large amount of GSH with the content of 0.7092，0.8374mol/g respectively，while fruit physalis contained higher amount of total thiol with the centent of 1.4173mol/g.The determination of total thiol and GSH proceeded with the accurate and sensitive method with the recovery range of 95.38%～101.9%，and lowest detection limits reached to 9.6×10-7，2.69×10-7mol/L respectively.

glutathione；thiol compound；derivitize；5，5-dithio-bis-nitrobenzoic acid；O-phthaldehde

TS207.3

A

1002－0306（2012）20－0060－05

2012－08－01 *通訊聯(lián)系人

樸玉蓮（1987－），女，碩士研究生，研究方向：有機分析。

國家自然基金資助項目（21165021）。