泰和烏骨雞活性肽對(duì)5- 氟尿嘧啶誘導(dǎo)HSF細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

田穎剛，王春艷，黃宇玫，廖春艷，張 盼，朱 勝，喬娟娟

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047;

2.南昌大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌 330029)

泰和烏骨雞活性肽對(duì)5- 氟尿嘧啶誘導(dǎo)HSF細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

田穎剛1，王春艷1，黃宇玫2，廖春艷1，張 盼1，朱 勝1，喬娟娟1

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047;

2.南昌大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌 330029)

目的:用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)(SCGE)研究泰和烏骨雞活性肽對(duì)5－氟尿嘧啶(5－FU)損傷細(xì)胞DNA的保護(hù)作用。方法:傳代培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞(HSF)，隨機(jī)分為正常對(duì)照組，5－FU組，5－FU+泰和烏骨雞活性肽組。應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，單細(xì)胞凝膠電泳法(SCGE)檢測(cè)5－FU引起HSF細(xì)胞DNA損傷程度，羥脯氨酸試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中羥脯氨酸含量。結(jié)果:與正常對(duì)照組比較:5－FU組HSF細(xì)胞DNA的損傷程度較嚴(yán)重，且尾長(zhǎng)、尾距、Olive尾距和尾部DNA百分含量顯著增加(p＜0.001)，細(xì)胞培養(yǎng)液中羥脯氨酸含量顯著性減少(p＜0.05)。與5－FU組比較，泰和烏骨雞活性肽組細(xì)胞的尾長(zhǎng)、尾距、Olive尾距和尾部DNA百分含量均顯著性減少(p＜0.001)，而細(xì)胞培養(yǎng)液上清中羥脯氨酸含量升高(p＜0.01)。結(jié)論:泰和烏骨雞活性肽對(duì)HSF細(xì)胞DNA損傷具有保護(hù)作用，泰和烏骨雞活性肽可以劑量依賴(lài)性地降低5－FU誘導(dǎo)的HSF細(xì)胞DNA的斷裂損傷。

泰和烏骨雞，活性肽，5－氟尿嘧啶，DNA損傷，單細(xì)胞凝膠電泳

5－氟尿嘧啶(5－fluorouracil，5－FU)為臨床常用的抗代謝類(lèi)腫瘤治療藥物，因其代謝轉(zhuǎn)化為5－氟脫氧尿嘧啶核甘酸(FDUMP)，抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶(TS)，從而抑制腫瘤細(xì)胞DNA復(fù)制合成，造成DNA損傷，從而發(fā)揮抗腫瘤作用［1］，該過(guò)程同樣會(huì)作用于正常細(xì)胞，如抑制成纖維細(xì)胞的增殖和膠原的合成，延遲傷口愈合［2－5］。因此需要通過(guò)改變給藥方式、修飾化療藥物結(jié)構(gòu)或者給予適當(dāng)?shù)慕舛緞┡湮榈确椒▉?lái)提高5－FU選擇性且降低其臨床毒副作用。研究表明，應(yīng)用生長(zhǎng)激素、谷氨酰胺能提高吻合口愈合強(qiáng)度，促進(jìn)術(shù)后早期腹腔化療條件下結(jié)腸吻合口愈合［6－7］。泰和烏骨雞是我國(guó)特有的藥食兩用滋補(bǔ)雞種，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為烏骨雞能補(bǔ)虛勞羸弱，滋陰清熱，治消渴心腹痛，益產(chǎn)婦，治女人崩中帶下、一切虛損諸病，其臨床療效已被廣為證實(shí)［8］。本課題組研究證明泰和烏骨雞活性肽具有非酶糖基化抑制作用［9］，良好的抗氧化作用［10］和一定程度的補(bǔ)血作用［11］。本文采用對(duì)DNA斷裂損傷較敏感的單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)探討泰和烏骨雞活性肽對(duì)5－FU誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞DNA損傷的保護(hù)作用，以期為烏骨雞功能活性的研究和臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

泰和烏骨雞活性肽 由新鮮的泰和烏骨雞，經(jīng)脫毛、去內(nèi)臟、絞成肉泥，然后采用蛋白酶酶解制得(詳見(jiàn)專(zhuān)利［12］);人皮膚成纖維細(xì)胞 美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所(ATCC)編號(hào)為842;胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司;DMEM培養(yǎng)基 美國(guó)Gibco公司;羥脯氨酸試劑盒 南京建成生物公司;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT) sigma公司;5－氟尿嘧啶 上海旭東海普藥業(yè)有限公司;胰蛋白酶 北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司;EDTANa2、Hepes 北京索萊寶科技有限公司;正常熔點(diǎn)瓊脂糖、低熔點(diǎn)瓊脂糖、溴化乙錠、Tris 生工生物工程(上海)有限公司; 96、6和12孔細(xì)胞培養(yǎng)板(平底) 美國(guó)Costor。

MK3型酶標(biāo)儀 上海熱電儀器有限公司; IDX－35B型高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;BHC－1300ⅡA/B3型生物安全柜 蘇凈集團(tuán)安泰公司; BDS200型倒置顯微鏡 北京福凱儀器有限公司; WJ－80A－111型二氧化碳培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;Ti－U型熒光倒置顯微鏡 日本尼康公司;SIMS00000型Milli－Q50超純水凈化系統(tǒng)

美國(guó)Millipore公司;DYY－Ⅲ2型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、DYCP－31B型電泳槽 北京市六一儀器廠;彗星圖象分析軟件(Casp－1.2.2)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人成纖維細(xì)胞的培養(yǎng) 將HSF細(xì)胞按5×105個(gè)/mL接種在DMEM高糖培養(yǎng)基中(pH7.4，含10% FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、10μmol/mL Hepes緩沖液、2μmol/mL L－谷氨酰胺)，二氧化碳培養(yǎng)箱溫育(37℃、5%CO2)。細(xì)胞為梭型貼壁生長(zhǎng)，每2～3d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 5－FU損傷模型建立 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HSF細(xì)胞以1×105個(gè)/孔密度接種于96孔板上，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入5－FU使其終濃度為50、100、200、400、800μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)時(shí)間終止后，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率［13］，每孔加入5mg/mL的MTT 20μL，溫育4h，去除培養(yǎng)液及MTT，每孔加入150μL二甲基亞砜，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在波長(zhǎng)490nm處吸光度。單細(xì)胞凝膠電泳法測(cè)定HSF細(xì)胞DNA損傷。

細(xì)胞存活率(%)=(正常組OD值－5－FU組OD值)/正常組OD值×100

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 實(shí)驗(yàn)分為5組，分別為正常對(duì)照組、5－FU模型組、泰和烏骨雞活性肽低、中、高劑量組。泰和烏骨雞活性肽組加入濃度為10、50、250μg/mL泰和烏骨雞活性肽。正常對(duì)照組、5－FU模型組加入等量培養(yǎng)液;于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，泰和烏骨雞活性肽組和5－FU模型組加入終濃度為100μg/mL 5－FU，正常對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)液。

1.2.4 MTT法測(cè)定HSF細(xì)胞存活率 取同代的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HSF細(xì)胞以1×105個(gè)/孔密度接種于96孔板上，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，按照1.2.3實(shí)驗(yàn)分組及給藥處理。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24和48h后采用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。

1.2.5 單細(xì)胞凝膠電泳法檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷

1.2.5.1 細(xì)胞處理及細(xì)胞懸液的制備 取同代的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HSF細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板上，按1.2.3實(shí)驗(yàn)分組及給藥處理。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，去除培養(yǎng)液，4℃ PBS洗一次，加入0.25%胰蛋白酶和 0.02%乙二胺四乙酸二鈉(EDTANa2)消化3min，1000r/min離心5min后收集細(xì)胞，用PBS重懸，密度為1×105個(gè)/mL。

1.2.5.2 制片 單細(xì)胞凝膠電泳方法采用Singh等的方法［14］稍加改進(jìn)后進(jìn)行。將加熱溶解的0.75%正常熔點(diǎn)瓊脂糖冷卻至45～60℃時(shí)，取120μL鋪于載玻片上，4℃凝固10min。取25μL單細(xì)胞懸液與37℃3倍體積0.75%的低熔點(diǎn)瓊脂糖混勻液，鋪于第二層膠上，4℃固定10min。

1.2.5.3 電泳 將膠板浸于4℃裂解液(含2.5mmol/mL NaCl，100μmol/mL EDTANa2，10μmol/mL Tris，pH10.0，臨用前加10%的DMSO，1%的TritonX－100)中裂解1.5h。取出載玻片用蒸餾水輕柔漂洗2次，以免瓊脂糖脫落，然后將膠板浸于4℃電泳緩沖液(1μmol/mL EDTANa2，300μmol/mL NaOH，pH13.0)解螺旋20min，電泳(25V，200mA)20min。

1.2.5.4 中和及染色 電泳結(jié)束后，膠板用中和緩沖液(0.4mmol/mL Tris，pH7.5)中和三次，每次5min，中和完全后用2μg/mL的EB 50μL染色1min，蒸餾水脫色10min。以上操作均在4℃暗處進(jìn)行。

1.2.5.5 結(jié)果觀察 熒光顯微鏡10×目鏡，20×物鏡下觀察結(jié)果(激發(fā)光波長(zhǎng)510～560nm)及拍照。每組隨機(jī)選擇100個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)，使用CASP軟件測(cè)量照片中尾長(zhǎng)、尾矩、Olive尾矩等指標(biāo)以反映細(xì)胞DNA的損傷程度。按照Kamer I的方法［15］利用彗星尾長(zhǎng)將DNA損傷分為四級(jí):A型(胞核清楚，尾長(zhǎng)不超過(guò)10μm)、B型(胞核清楚，尾長(zhǎng)在10～30μm之間)、C型(胞核熒光強(qiáng)度低，尾長(zhǎng)在30～40μm之間)和D型(胞核和慧尾不能區(qū)分，尾長(zhǎng)超過(guò)40μm)。計(jì)算公式如下:

尾長(zhǎng)=彗星頭的右邊界到彗星尾部末端的距離

尾距=尾長(zhǎng)×尾部DNA百分比

Olive尾距=從頭光密度重心到尾光密度重心的距離×尾部DNA百分比。

1.2.6 羥脯氨酸含量的測(cè)定及膠原含量的計(jì)算 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSF，制成細(xì)胞懸液，以1×10個(gè)/孔接種于12孔板。按1.2.3實(shí)驗(yàn)分組及給藥處理，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，作用終止時(shí)吸取上清液0.5mL測(cè)羥脯氨酸含量。具體操作按羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，測(cè)定上清液中羥脯氨酸在550nm處的吸光值(A值)，并根據(jù)公式計(jì)算羥脯氨酸含量，間接反映HSF細(xì)胞膠原含量。計(jì)算公式如下:5

表1 5－FU對(duì)HSF細(xì)胞DNA損傷的作用(±S，n=100)Table 1 Effect of 5－FU on DNA damage in HSF(±S，n=100)

表1 5－FU對(duì)HSF細(xì)胞DNA損傷的作用(±S，n=100)Table 1 Effect of 5－FU on DNA damage in HSF(±S，n=100)

注:與正常對(duì)照組相比，＊＊＊p＜0.001。

組別 藥物質(zhì)量濃度(μg·mL－1) 彗星率(%) 尾部DNA含量(%)尾長(zhǎng)(μm) 尾距 Olive 尾距正常對(duì)照組 / 4.00 0.77±8.46 3.58±2.20 0.047±0.10 0.17±0.27 5－FU組 50 58.50 6.19±5.76＊＊＊ 12.98±9.74＊＊＊ 1.34±2.02＊＊＊ 1.58±1.61＊＊＊5－FU組 100 98.09 27.13±1.10＊＊＊ 34.78±11.01＊＊＊ 10.11±5.07＊＊＊ 8.31±2.80＊＊＊5－FU組 200 100.00 35.27±14.14＊＊＊ 51.18±15.25＊＊＊ 19.89±12.75＊＊＊ 12.78±6.10＊＊＊

表2 泰和烏骨雞活性肽對(duì)5－FU誘導(dǎo)HSF細(xì)胞增殖抑制的影響(±S，n=6)Table 2 Protective effect of bioactive peptides from TBSF on 5－FU－induced inhibition of proliferation in HSF(±S，n=6)

表2 泰和烏骨雞活性肽對(duì)5－FU誘導(dǎo)HSF細(xì)胞增殖抑制的影響(±S，n=6)Table 2 Protective effect of bioactive peptides from TBSF on 5－FU－induced inhibition of proliferation in HSF(±S，n=6)

注:與正常對(duì)照組相比，*p＜0.05，＊＊＊p＜0.001;與5－FU損傷組相比，ap＜0.05，bp＜0.001;表3～表4同。

組別 藥物質(zhì)量濃度(μg·mL－1) 24h存活率(%) 48h存活率(%) 100±3.73 100±1.49 5－FU損傷組 100 85.46±3.81＊＊＊ 51.18±0.81＊＊＊泰和烏骨雞活性肽組 10 91.40±2.49b 67.95±2.19c泰和烏骨雞活性肽組 50 94.06±2.84c 71.95±2.63c泰和烏骨雞活性肽組 250 99.77±3.74c 74.79±3.82正常對(duì)照組/ c

式中:A0為空白管吸光度;A1為標(biāo)準(zhǔn)管吸光度; A2為測(cè)定管吸光度。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度5-FU對(duì)HSF細(xì)胞存活率的影響

如圖1所示，不同濃度的5－FU作用于HSF細(xì)胞24h后，隨著作用濃度增加細(xì)胞存活率與正常對(duì)照組相比顯著降低。濃度50、100μg/mL作用細(xì)胞存活率與正常對(duì)照組有顯著變化(p＜0.01)，但細(xì)胞存活率都在80%以上，濃度為大于等于200μg/mL 5－FU已出現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性，細(xì)胞存活率為小于75%。由于單細(xì)胞凝膠電泳要求細(xì)胞存活率應(yīng)在80%以上，因此選用濃度50、100、200μg/mL的5－FU篩選單細(xì)胞凝膠電泳最適作用濃度。

2.2 不同濃度5-FU對(duì)HSF細(xì)胞DNA損傷作用

如表1所示，不同濃度的5－FU作用HSF細(xì)胞24h后，與正常組比較，5－FU的各劑量組均可導(dǎo)致HSF細(xì)胞DNA出現(xiàn)不同程度的損傷，隨著5－FU質(zhì)量濃度增大，彗星率、尾長(zhǎng)、尾距、Olive尾距和尾部DNA含量顯著增加(p＜0.001)。50μg/mL實(shí)驗(yàn)組對(duì)HSF細(xì)胞彗星率只有58.50%，屬于B型損傷，該損失比較輕微不適合作為單細(xì)胞凝膠電泳模型作用濃度。100μg/mL實(shí)驗(yàn)組對(duì) HSF細(xì)胞彗星率為98.09%，屬于C型損傷。200μg/mL實(shí)驗(yàn)組對(duì)HSF細(xì)胞彗星率100%，且為D型損傷，對(duì)細(xì)胞的損傷非常嚴(yán)重，凋亡細(xì)胞比較多。故采用 100μg/mL的5－FU作為HSF細(xì)胞損傷模型。

圖1 5－FU對(duì)HSF細(xì)胞存活率的影響(±S，n=6)Fig.1 Effect of 5－FU on HSF survival(±S，n=6)

2.3 泰和烏骨雞活性肽對(duì)5-FU抑制HSF細(xì)胞增殖影響

如表2所示，泰和烏骨雞活性肽對(duì)5－FU誘導(dǎo)HSF存活率降低具有保護(hù)作用。與對(duì)照組比較，5－FU組可顯著性抑制HSF細(xì)胞的增長(zhǎng)(p＜0.001)，與5－FU組比較，泰和烏骨雞活性肽組細(xì)胞存活率具有顯著性差異(p＜0.05)，且當(dāng)5－FU作用48h時(shí)泰和烏骨雞活性肽組與5－FU組相比具有極顯著性差異(p＜0.001)，表明泰和烏骨雞活性肽能抑制5－FU誘導(dǎo)的HSF存活率下降。

2.4 泰和烏骨雞活性肽對(duì)5-FU所致HSF細(xì)胞DNA損傷保護(hù)作用

如表3所示，不同濃度的泰和烏骨雞活性肽均能顯著降低5－FU對(duì)HSF細(xì)胞DNA損傷作用，其中在10～250μg/mL濃度范圍內(nèi)，隨著泰和烏骨雞活性肽濃度的增加，抗損傷作用加強(qiáng)，泰和烏骨雞活性肽組細(xì)胞的彗星率、尾長(zhǎng)、尾距、Olive尾距和尾部DNA含量與5－FU組相比具有顯著性差異(p＜0.001)。與空白對(duì)照組相比，250μg/mL泰和烏骨雞活性肽作用組沒(méi)有顯著性差異，表明該濃度下，泰和烏骨雞活性肽可完全對(duì)抗5－FU誘導(dǎo)的DNA損傷。

表3 泰和烏骨雞活性肽對(duì)5－FU誘導(dǎo)HSF細(xì)胞DNA損傷的保護(hù)作用(±S，n=100)Table 3 Protective effect of bioactive peptides from TBSF on 5－FU－induced DNA damage in HSF(±S，n=100)

表3 泰和烏骨雞活性肽對(duì)5－FU誘導(dǎo)HSF細(xì)胞DNA損傷的保護(hù)作用(±S，n=100)Table 3 Protective effect of bioactive peptides from TBSF on 5－FU－induced DNA damage in HSF(±S，n=100)

組別 藥物質(zhì)量濃度(μg·mL－1)彗星率(%)尾部DNA含量(%)尾長(zhǎng)(μm) 尾距 Olive 27 5－FU損傷組 100 98.09 27.13±1.11＊＊＊ 34.78±11.01＊＊＊ 10.11±5.07＊＊＊ 8.31±2.80＊＊泰和烏骨雞活性肽組 10 61.50 9.43±7.76c 18.00±11.50c 2.52±2.91c 2.57±2.26c泰和烏骨雞活性肽組 50 30.70 4.47±4.63c 9.69±8.96c 0.79±1.37c 1.08±1.22c泰和烏骨雞活性肽組 250 4.00 0.92±2.09c 3.49±1.70c 0.06±0.21c 0.18±0.43尾距正常對(duì)照組 / 4.00 0.77±8.46 3.85±2.20 0.05±0.10 0.17±0.c

表4 泰和烏骨雞活性肽對(duì)5－FU抑制HSF細(xì)胞合成羥脯氨酸和膠原含量的保護(hù)作用(±S，n=3)Table 4 Protective effect of bioactive peptides from TBSF on 5－FU－induced inhibition of hydroxyproline and collagen synthesis in HSF(±S，n=3)

表4 泰和烏骨雞活性肽對(duì)5－FU抑制HSF細(xì)胞合成羥脯氨酸和膠原含量的保護(hù)作用(±S，n=3)Table 4 Protective effect of bioactive peptides from TBSF on 5－FU－induced inhibition of hydroxyproline and collagen synthesis in HSF(±S，n=3)

組別 藥物質(zhì)量濃度(μg·mL－1) 羥脯氨酸含量(μg·mL－1) 膠原含量(μg·mL－1) 2.93±0.128 21.89±0.95 5－FU損傷組 100 2.55±0.128* 19.04±0.95*泰和烏骨雞活性肽 10 3.06±0.128b 22.85±0.95b泰和烏骨雞活性肽 50 3.57±0.26b 26.65±1.9b泰和烏骨雞活性肽 250 3.70±0.38b 27.6043±2.86正常對(duì)照組/ b

制備好的凝膠片在熒光顯微鏡下觀察時(shí)，可見(jiàn)DNA被EB染成紅色，未發(fā)生DNA斷裂的細(xì)胞表現(xiàn)為一圓形類(lèi)核，即彗星頭部，熒光強(qiáng)度均勻，邊緣整齊(圖2(a))，正常組未受5－FU損傷的HSF細(xì)胞成圓形亮團(tuán);而發(fā)生DNA斷裂的細(xì)胞則表現(xiàn)為斷片向陽(yáng)極方向遷移，形成彗星樣的拖尾(圖2(b))，5－FU組的HSF細(xì)胞在5－FU作用下，DNA分子受損嚴(yán)重，呈明顯的彗星樣變化。而預(yù)先應(yīng)用250μg/mL泰和烏骨雞活性肽處理后的高劑量實(shí)驗(yàn)組的HSF細(xì)胞DNA分子完整，影像與正常對(duì)照組相似。應(yīng)用10、50μg/mL的泰和烏骨雞活性肽的低、中劑量組的HSF細(xì)胞雖仍有彗星樣的形態(tài)，但其尾跡也較5－FU組短且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

圖2 泰和烏骨雞活性肽對(duì)5－FU誘導(dǎo)HSF細(xì)胞DNA損傷保護(hù)作用的彗星圖形(×200)Fig.2 Comet picture of the protective effect of bioactive peptides from TBSF on 5－FU－induced DNA damage in HSF(×200)

2.5 泰和烏骨雞活性肽對(duì)5-FU誘導(dǎo)HSF細(xì)胞合成羥脯氨酸和膠原的影響

如表4所示，與正常組相比，5－FU損傷組可以顯著抑制羥脯氨酸的合成(p＜0.05)，不同濃度的泰和烏骨雞活性肽均能降低5－FU的抑制作用，與5－FU損傷組相比均可顯著增加HSF細(xì)胞培養(yǎng)液中羥脯氨酸的含量(p＜0.01)。表明泰和烏骨雞活性肽在10～250μg/mL濃度范圍內(nèi)可以促進(jìn)HSF細(xì)胞分泌羥脯氨酸。

3 討論

目前直接或間接測(cè)定DNA損傷常用技術(shù)有單細(xì)胞凝膠電泳、環(huán)境誘變物短期篩選實(shí)驗(yàn)(SOS/umu實(shí)驗(yàn))、微核實(shí)驗(yàn)(MN)和姐妹染色體交換實(shí)驗(yàn)(SCE)等［16］。單細(xì)胞凝膠電泳又稱(chēng)為彗星實(shí)驗(yàn)，是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種在單細(xì)胞水平上檢測(cè)真核細(xì)胞DNA損傷的方法［17］。該方法具有所需樣品量少，簡(jiǎn)便，快速，無(wú)需放射性標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，廣泛地應(yīng)用于DNA放射損傷、DNA剪切損傷、DNA交聯(lián)的檢測(cè)、藥物的毒性評(píng)價(jià)、細(xì)胞凋亡鑒定等工作中［18－20］。

盡管單細(xì)胞凝膠電泳已被應(yīng)用20多年，但其檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞DNA損傷的確切機(jī)理還不清楚，一般認(rèn)為真核細(xì)胞的DNA分子量較大，DNA呈負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)附著在核基質(zhì)上。當(dāng)各種內(nèi)源性和外源性DNA損傷因子誘發(fā)細(xì)胞DNA鏈斷裂時(shí)，DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)受到破壞，在堿處理和堿性電解質(zhì)的作用下，DNA發(fā)生解螺旋，損傷的DNA斷鏈及片段被釋放出來(lái)，由于這些DNA的分子量很小，所以在電泳過(guò)程中會(huì)離開(kāi)核DNA向陽(yáng)極移動(dòng)，因而形成了彗星的尾部，而較大的一些碎段位置則靠近細(xì)胞核，因而形成彗星的頭部。而未損傷的細(xì)胞，其核DNA仍停留在核基質(zhì)中，經(jīng)熒光染色后呈現(xiàn)圓形的熒光團(tuán)，無(wú)拖尾現(xiàn)象。在一定條件下，彗星尾長(zhǎng)和DNA含量分布與DNA損傷程度呈線性相關(guān)，因此尾矩被作為SCGE定量分析的主要依據(jù)［21］。本研究以HSF細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以5－FU作為DNA攻擊劑，造成HSF細(xì)胞DNA損傷。從表3和圖2可以看出，正常對(duì)照組細(xì)胞成圓形，沒(méi)有拖尾現(xiàn)象，5－FU組細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的彗星樣，而泰和烏骨雞活性肽預(yù)處理組隨著藥物濃度的增加，出現(xiàn)彗尾的細(xì)胞數(shù)越來(lái)越少，細(xì)胞彗尾越來(lái)越短，直至沒(méi)有。提示泰和烏骨雞活性肽對(duì)5－FU造成的HSF細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用。

膠原是真皮細(xì)胞間質(zhì)中的主要有形成分，由人皮膚成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)維持皮膚厚度、張力、緩沖外界創(chuàng)傷有重要作用。羥脯氨酸在膠原蛋白中具有高度特異性且含量穩(wěn)定，其含量約為膠原蛋白的13.4%，在彈力纖維中含量甚微，而其它蛋白中不存在，因此羥脯氨酸的含量可大致反映膠原蛋白的含量。本研究發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組HSF細(xì)胞比較，5－FU組HSF細(xì)胞增殖能力明顯減退，膠原合成能力降低。泰和烏骨雞活性肽在10～250μg/mL濃度范圍內(nèi)可促進(jìn)HSF細(xì)胞增殖，增加膠原的合成，且在該劑量范圍內(nèi)呈量效關(guān)系。因此推測(cè)泰和烏骨雞活性肽對(duì)HSF膠原合成影響的原因?yàn)?a.通過(guò)改變HSF的數(shù)量，促進(jìn)HSF增殖從而提高膠原的合成。b.泰和烏骨雞活性肽改變了HSF細(xì)胞某些生物學(xué)特性，提高了單個(gè)HSF細(xì)胞的膠原合成能力。

本文研究結(jié)果表明5－FU可顯著性抑制HSF細(xì)胞的增殖，造成HSF細(xì)胞DNA的損傷。然而在5－FU作用體系中加入泰和烏骨雞活性肽后，MTT法對(duì)細(xì)胞存活率的測(cè)定表明泰和烏骨雞活性肽對(duì)5－FU誘導(dǎo)HSF細(xì)胞增殖抑制具有顯著的保護(hù)作用，單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果顯示泰和烏骨雞活性肽組細(xì)胞彗星尾長(zhǎng)、尾矩、Olive尾距和尾部DNA百分含量與5－FU組比較明顯減少，泰和烏骨雞活性肽可以有效地減少5－FU引起的HSF細(xì)胞DNA的斷裂損傷和提高HSF細(xì)胞分泌膠原蛋白的能力。綜上所述，體外實(shí)驗(yàn)表明泰和烏骨雞活性肽可以有效對(duì)抗細(xì)胞DNA損傷，其作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步的研究。

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Protective effect of bioactive peptides from taihe black－bone silky fowls on human skin fibroblasts injured by 5－fluorouracil

TIAN Ying－gang1，WANG Chun－yan1，HUANG Yu－mei2，LIAO Chun－yan1，ZHANG Pan1，ZHU Sheng1，QIAO Juan－juan1
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China;
2.College of Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330029，China)

Objective:A DNA injury model was established by using 5－fluorouracil(5－FU)in this study.Methods:A series of experiments(MTT assay，single cell gel electrophoresis(SCGE)，and hydroxyproline assay kits)were designed to investigate the effect of bioactive peptides from Taihe Black－Bone Silky Fowl(TBSF)on Human Skin Fibroblasts(HSF)against 5－FU－induced DNA damage.Cultured HSF were randomly divided into three groups:the control group，5－fluorouracil group and 5－fluorouracil+bioactive peptides from TBSF.Cell viability was measured by MTT assay，DNA damage was detected by SCGE assay，and hydroxyproline levels in HSF culture medium were measured by hydroxyproline assay kits.Results:compared with the control group，5－FU group exacerbated the DNA damage，in which the tail length，the tail moment，the Olive tail moment，and the tail DNA content significantly increased(p＜0.001)，whereas the content of hydroxyproline in HSF culture medium significantly decreased(p＜0.05).Compared with 5－FU group，Bioactive peptides from TBSF attenuated 5－FU－induced DNA damage，in which the tail length，the tail moment，the Olive tail moment and the tail DNA content significantly decreased(p＜0.05)，whereas the content of hydroxyproline increased dramatically(p＜0.01).Conclusion:Bioactive peptides from TBSF can protect HSF against 5－FU－induced DNA damage in a dose－dependent manner.

black－bone silky fowl;bioactive peptides;5－fluorouracil;DNA damage;single cell gel electrophoresis

TS201.4

A

1002－0306(2012)21－0356－05

2012－04－23

田穎剛(1972－)，男，博士，副研究員，研究方向:食品化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)。

江西省青年科學(xué)家培養(yǎng)計(jì)劃(2010)資助項(xiàng)目(贛科發(fā)計(jì)字［2010］209號(hào))。