白附子酪氨酸酶活性抑制成分的提取與分離

穆 燕，魏海柳，李 琳，張喜梅，董方圓，胡松青

（華南理工大學(xué) 輕工與食品學(xué)院，廣東廣州 510640）

白附子酪氨酸酶活性抑制成分的提取與分離

穆 燕，魏海柳，李 琳，張喜梅，董方圓，胡松青*

（華南理工大學(xué) 輕工與食品學(xué)院，廣東廣州 510640）

研究了不同溶劑及提取方式對(duì)白附子中酪氨酸酶抑制成分的影響，并應(yīng)用活性追蹤法對(duì)白附子中酪氨酸酶活性抑制成分進(jìn)行考察。結(jié)果表明，以20%乙醇水溶液為溶劑從白附子中提取的粗提物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用最強(qiáng)，抑制率可達(dá)到96.35%，與恒溫水浴振蕩提取法相比，超聲波輔助提取法對(duì)活性成分的提取效果更好。在此提取條件下所得白附子粗提物對(duì)酪氨酸酶的半抑制濃度IC50為24.69mg/mL。該粗提物依次經(jīng)乙醚和正丁醇萃取，所得正丁醇萃取組分對(duì)酪氨酸酶的抑制率達(dá)71.94%。對(duì)高活性的正丁醇萃取組分進(jìn)行分離，獲得了一種酪氨酸酶抑制率高達(dá)98.82%的組分，是一種潛在的酪氨酸酶抑制劑。研究結(jié)果對(duì)白附子及其活性組分在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域的應(yīng)用有指導(dǎo)意義。

白附子，酪氨酸酶，抑制率，提取分離

酪氨酸酶（EC.1.14.18.1）是一種含銅的氧化還原酶，廣泛存在于生物體中。植物酪氨酸酶與一些水果和蔬菜加工過程中的褐變有關(guān)，不利的酶促褐變會(huì)導(dǎo)致食品營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的減少以及經(jīng)濟(jì)損失；哺乳動(dòng)物酪氨酸酶常見于黑色素細(xì)胞中，酪氨酸酶是目前已知的生物體中參與黑色素（Melanin）合成的關(guān)鍵酶[1-2]，不僅決定黑色素合成的速率，還是黑色素細(xì)胞分化成熟的特征性標(biāo)志[3]，其異常過量表達(dá)可導(dǎo)致人體的色素沉著性疾病，如雀斑、黃褐斑、老年斑[4]，在食品工業(yè)中酪氨酸酶抑制劑被作為食品保鮮劑[5]。隨著對(duì)酪氨酸酶了解的不斷深入，從植物中尋找高效、安全的酪氨酸酶活性抑制劑已成為重要研究方向，其生物活性和作用也將越來(lái)越受到人們的重視。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)多種植物提取物對(duì)酪氨酸酶有顯著的抑制作用，如青梅花[6]、龍井[7]、柿葉[8]以及多種中草藥[9]。白附子為天南星科梨頭尖屬植物獨(dú)角蓮（Typhonium giganteum Engl）的地下塊莖，收載于我國(guó)2010版藥典[10]。在中藥美容藥方中，白附子出現(xiàn)頻率較高，占20%以上[11]。白附子的主要成分是脂肪酸、甾醇類化合物、揮發(fā)油成分和氨基酸等[12]，近年來(lái)對(duì)白附子抗腫瘤、抗菌、抗炎等作用的研究很多[13]，關(guān)于白附子的美白作用研究是相關(guān)研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。本文采用超聲輔助提取白附子中有效成分，探討白附子提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用，并應(yīng)用有機(jī)溶劑萃取、硅膠柱層析等分離手段，獲得對(duì)酪氨酸酶具有較強(qiáng)抑制作用的活性組分。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白附子 產(chǎn)地吉林省吉林市；氯仿、甲醇 天津大茂化學(xué)試劑廠，分析純；正丁醇 江蘇強(qiáng)盛化工有限公司，分析純；乙醚 廣州化學(xué)試劑廠，分析純；L-酪氨酸 上海伯奧生物科技有限公司，生化試劑；酪氨酸酶 德國(guó)Sigma公司，生化試劑；磷酸二氫鉀 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，生化試劑；硅膠 青島譜科分離材料有限公司，100～200目。

GF254型硅膠板 青島海洋化工廠分廠；BS210S型分析天平 德國(guó)Sartorius公司，T1-H-25型超聲波清洗機(jī) 德國(guó)Elma公司；KR25i型高速冷凍離心機(jī)法國(guó)Jouan公司；UV-2102PC型紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器公司；DHG-9145A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海恒科有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵 鞏義市英裕予華儀器廠；PB-10型電子pH計(jì) 德國(guó)Sartorius公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酪氨酸酶抑制率的測(cè)定 酪氨酸酶活性的測(cè)定參照文獻(xiàn)[14-15]并做適當(dāng)修改。樣品溶于10%的DMSO溶液。將酶解反應(yīng)底物L(fēng)-酪氨酸溶于pH6.8的磷酸鹽緩沖溶液中，配制成濃度為1.0mmol/L的L-酪氨酸溶液，將1mL的L-酪氨酸溶液加入編號(hào)為1、2、3的三支試管中，在1號(hào)試管中加入1mL磷酸鹽緩沖溶液，在2、3號(hào)試管中加入1mL已配制好的白附子分離組分溶液，然后在1、2號(hào)試管加入0.5mL酪氨酸酶溶液（溶于pH6.8磷酸鹽緩沖溶液），用pH6.8磷酸鹽緩沖溶液將三個(gè)試管內(nèi)的溶液體積補(bǔ)至3mL，體系中酶的終濃度為173U/mL。將1、2、3號(hào)試管于30℃孵育30min后在475nm處測(cè)其吸光值，記為A1、A2、A3。按式（1）計(jì)算白附子分離組分對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率：

1.2.2 白附子粗提物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

1.2.2.1 不同溶劑提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用 白附子原料粉碎后準(zhǔn)確稱取白附子樣品10g于150mL錐形瓶?jī)?nèi)，分別用純水與20%、40%、60%、80%的乙醇-水溶液50mL在50℃下恒溫水浴提取1h，中速濾紙過濾后將濾液加3倍體積無(wú)水乙醇，置于4℃冰箱內(nèi)靜置24h將多糖鞣質(zhì)等雜質(zhì)沉降。沉降后粗提液于4000r/min高速離心15min后棄殘?jiān)?，上清液?0℃減壓濃縮去除乙醇，將濃縮液定容到50mL不同濃度乙醇水溶液提取的白附子粗提液，采用1.2.1所述方法測(cè)定各粗提物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率。

1.2.2.2 超聲波及恒溫水浴提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用 根據(jù)1.2.2.1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定提取白附子中酪氨酸酶抑制有效成分的溶劑為20%乙醇水溶液，提取溫度為50℃，提取時(shí)間為1h。分別在頻率35kHz、功率1300W的超聲水浴和轉(zhuǎn)速150r/min的恒溫水浴振蕩條件下提取白附子有效成分，并采用1.2.2.1所述方法處理粗提液并測(cè)量其對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率。

1.2.3 有機(jī)溶劑萃取分離白附子超聲輔助提取物按1.2.2.2所述方法采用超聲輔助提取白附子有效成分，將粗提液于50℃減壓濃縮去除乙醇得到的白附子膏狀提取物用蒸餾水混懸至密度為1.1～1.2g/cm3，依次用等體積的乙醚、正丁醇反復(fù)萃取4次。將獲得的萃取液減壓濃縮除去溶劑，分別記為乙醚相、正丁醇相、水相。各組分配制成10mg/mL粗分離液，測(cè)定其對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率。

1.2.4 硅膠柱層析分離 用氯仿浸泡硅膠24h后濕法裝柱。將正丁醇相萃取物與硅膠以1∶10的比例拌樣后上樣。用氯仿/甲醇（V/V）混合溶劑線性梯度洗脫（氯仿∶甲醇，100∶0→50∶50），按柱體積收集流出組分。室溫下用硅膠G薄層板以氯仿-甲醇溶液作展開劑、碘蒸氣為顯色劑對(duì)流出組分進(jìn)行薄層層析（TLC）示蹤，根據(jù)TLC檢測(cè)結(jié)果對(duì)分離部位進(jìn)行合并，得到9個(gè)組分（A-I），將各組分去除有機(jī)溶劑后測(cè)定其對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率。

2 結(jié)果與討論

2.1不同溶劑白附子粗提物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用

表1 不同溶劑提取物對(duì)酪氨酸酶活性的影響Table 1 Effect of extracts by different solvents on tyrosinase activity

不同濃度溶劑對(duì)提取白附子中酪氨酸酶活性成分的影響見表1。提取溶劑分別為水、20%乙醇水溶液、40%乙醇水溶液、60%乙醇水溶液和80%乙醇水溶液時(shí)，所得粗提物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率分別為33.99%、96.35%、4.41%、-3.57%和-16.58%。在所選的提取溶劑中，采用20%乙醇水溶液為提取溶劑所獲得的粗提物基本可以完全抑制酪氨酸酶的活性，抑制率高達(dá)到96.35%，遠(yuǎn)高于采用其他溶劑體系下的白附子粗提物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%或80%時(shí)，所獲得的粗提物溶液對(duì)酪氨酸酶表現(xiàn)出輕微的激活作用。根據(jù)“相似相溶”原理可以推測(cè)白附子中抑制酪氨酸酶活性的主要成分為大極性組分。據(jù)此，本文后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇20%乙醇水溶液為提取溶劑來(lái)研究白附子中酪氨酸酶活性抑制組分。

2.2 不同提取方式的粗提物對(duì)酪氨酸酶活性抑制作用研究

固定其他條件不變，分別采用超聲波輔助與恒溫水浴振蕩提取了白附子中的活性成分，并研究了粗提物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率。結(jié)果表明，兩種提取方法所得的粗提物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率均超過90%，分別為98.1%和90.7%，即超聲波輔助提取所得白附子粗提物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用比恒溫水浴振蕩提取提高了7.4%。兩種提取方法所用的提取溶劑及提取溫度相同，所得到的粗提物成分基本一致；一般地，酪氨酸酶活性會(huì)隨加入抑制劑的濃度而變化。因此，兩種提取方法所得粗提物溶液對(duì)酪氨酸酶活性的抑制效果不同，是因粗提物中有效成分的含量不同所導(dǎo)致，在相同的提取時(shí)間內(nèi)，采用超聲波輔助提取，可以從白附子中提取出更多的活性成分。

2.3 白附子粗提物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用研究

白附子粗提液對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用如圖1所示。結(jié)果表明白附子粗提液對(duì)酪氨酸酶活性有較好的抑制作用，且其對(duì)酪氨酸酶的抑制作用呈濃度依賴性。以抑制率I（%）為因變量，白附子粗提物濃度C（mg/mL）為自變量，對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合得如式（2）所示的線性方程[16]，相關(guān)系數(shù)R2=0.99，表明在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)范圍內(nèi)，式（2）能較好地模擬白附子粗提物對(duì)酪氨酸酶活性抑制率I與濃度C之間的關(guān)系。

I（%）=2.60C-14.20式（2）

根據(jù)式（2）計(jì)算得到酪氨酸酶抑制率為50%時(shí)的白附子粗提物濃度（IC50）為24.69mg/mL。該半抑制率濃度雖然遠(yuǎn)低于化妝品中常用的酪氨酸酶抑制劑熊果苷的半抑制濃度（1.44mg/mL）[17]，但是，作為植物來(lái)源的粗提物用于抑制酪氨酸酶活性具有一定的應(yīng)用前景。而且，通過進(jìn)一步研究粗提物中的高效、安全的酪氨酸酶抑制劑，將對(duì)開發(fā)天然的酪氨酸酶抑制劑提供重要依據(jù)。

圖1 白附子粗提物對(duì)酪氨酸酶活性的影響Fig.1 Effect of crude extract of RT on tyrosinase activity

2.4 白附子粗提物的分離產(chǎn)物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

圖2 不同溶劑萃取物對(duì)酪氨酸酶活性的影響Fig.2 Effect of extract by different solvents from crude extract on tyrosinase activity

表2 正丁醇相分離產(chǎn)物對(duì)酪氨酸酶活性的影響Table 2 Effect of extract of butanol on tyrosinase activity

白附子粗提物經(jīng)乙醚、正丁醇依次萃取后，各組分對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用如圖2所示。結(jié)果表明，在相同濃度下，乙醚萃取物溶液和水萃取物對(duì)酪氨酸酶活性幾乎沒有抑制作用，均低于10%。與之相比，正丁醇萃取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率則高達(dá)71.94%，表明白附子粗提物中具有抑制酪氨酸酶活性的主要物質(zhì)被富集到正丁醇中。

為了進(jìn)一步分離純化白附子中酪氨酸酶活性抑制的有效成分，采用硅膠柱層析分離正丁醇萃取部位，共獲得了9個(gè)不同的組分，其對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率如表2所示。由表2可見，D、E、F、G、H對(duì)酪氨酸酶活性表現(xiàn)出不同程度的抑制效果，其中由洗脫液為氯仿∶甲醇=8∶2的洗脫組分E對(duì)酪氨酸酶的抑制作用最強(qiáng)，其對(duì)酪氨酸酶的抑制率為98.82%，幾乎完全抑制酪氨酸酶活性，不但高于其他組分，而且高于正丁醇萃取物，說明組分E很有可能是是白附子中抑制酪氨酸酶活性的成分的主要來(lái)源；組分D、F、G和H對(duì)酪氨酸酶都有一定的抑制作用，但都明顯低于組分E，也低于白附子正丁醇萃取物。組分A、B、C和I為非極性組分和大極性組分，對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率分別為-5.09%、-29.63%、-69.76%和-45.85%，表明它們不但對(duì)酪氨酸酶活性沒有抑制作用，反而具有激活作用，其中組分C的激活率最高。

3 結(jié)論與展望

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以20%乙醇水溶液為提取溶劑，應(yīng)用超聲輔助法提取可以從白附子中獲得對(duì)酪氨酸酶活性具有顯著抑制作用的粗提物；通過粗提物對(duì)酪氨酸酶活性抑制作用的研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)酪氨酸酶抑制效果明顯，且具有濃度依賴性，其對(duì)酪氨酸酶的半抑制率濃度IC50為24.69mg/mL。利用不同種萃取劑對(duì)粗提物進(jìn)行萃取分離，發(fā)現(xiàn)正丁醇萃取物對(duì)酪氨酸酶活性具有較高的抑制率；進(jìn)一步應(yīng)用硅膠柱層析對(duì)正丁醇萃取物進(jìn)行分離，在洗脫液為氯仿∶甲醇=8∶2時(shí)收集到對(duì)酪氨酸表現(xiàn)出強(qiáng)抑制效果的組分，其對(duì)酪氨酸酶的抑制率高達(dá)98.82%。

本研究從白附子中獲得了對(duì)酪氨酸酶具有較強(qiáng)抑制效果的組分，雖然該組分并非單一物質(zhì)，深入的分離純化工作尚待進(jìn)一步探討，但是，將該組分直接作為酪氨酸酶抑制劑應(yīng)用于食品工業(yè)、化妝品工業(yè)乃至農(nóng)業(yè)中，既可以達(dá)到應(yīng)用效果，又能節(jié)約工業(yè)成本。另外，該方面的深入研究有望獲得天然產(chǎn)物來(lái)源的高活性酪氨酸抑制單體化合物，對(duì)白附子及其有效成分的酪氨酸酶活性抑制劑的開發(fā)和應(yīng)用有指導(dǎo)意義。

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Extraction and isolation of crude tyrosinase inhibitory compounds from Rhizoma Typhonii

MU Yan，WEI Hai-liu，LI Lin，ZHANG Xi-mei，DONG Fang-yuan，HU Song-qing*
（College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

The extracting solvent and conditions were evaluated to extract compounds with tyrosinase inhibitory effect from Rhizoma Typhonii（RT） and the inhibitory effect of the crude extract of RT was also discussed.Compounds extracted with 20%ethanol aqueous solvent presented the best inhibition ability on tyrosinase with tyrosinase inhibitory rate of 96.35%.Additionally，more effective compounds were extracted by ultrasoundassisted extraction method than that of shaking method.Results showed that crude extract of RT could well inhibit tyrosinase activity with an IC50value of 24.69 mg/mL.The crude extract was extracted by ether and nbutyl alcohol in succession.Constitutes in n-butyl alcohol layer could inhibit tyrosinase activity with an inhibitory rate of 71.94%.Moreover，extracts in n-butyl alcohol layer were separated on a silica gel column，and the compounds with an inhibition rate of 98.82%on tyrosinase were obtained，which was a potential tyrosinase inhibitor.Study result will be beneficial to the application of RT and its effective compounds in medicine and food industry.

Rhizome Typhonium；tyrosinase；inhibition rate；extraction and separation

TS201.2

B

1002-0306（2012）11-0247-04

2011－11－29 * 通訊聯(lián)系人

穆燕（1984-），女，博士，主要從事天然產(chǎn)物分離純化的研究。

新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃（NCET-10-0362）；華南理工大學(xué)中央高校經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（2012ZG0007）。