葵花籽殼黑色素提取鑒定及抗氧化性研究

趙 萍，王 雅，魏明廣，郭 濤，張 軼，亓文靜，柴原琴，林櫻姬

（1.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州 730050；

2.甘肅敬業(yè)農(nóng)業(yè)科技有限公司，甘肅武威 733300）

葵花籽殼黑色素提取鑒定及抗氧化性研究

趙 萍1，王 雅1，魏明廣2，郭 濤1，張 軼1，亓文靜1，柴原琴1，林櫻姬1

（1.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州 730050；

2.甘肅敬業(yè)農(nóng)業(yè)科技有限公司，甘肅武威 733300）

利用堿提酸沉和超聲波等方法從葵花籽殼中提取黑色素，F(xiàn)olin-Ciocalteu法測定葵花籽殼黑色素粗提取物中總酚的含量，采用單因素和正交實驗確定葵花籽殼黑色素提取的最佳工藝條件，紫外和紅外光譜法初步鑒定黑色素；以VC、沒食子酸為對照，測定黑色素粗提物與純化黑色素的還原力和清除DPPH·的能力。結果表明，堿提酸沉葵花籽殼黑色素粗提物呈黑色、無光澤，最優(yōu)提取條件下氫氧化鈉濃度為0.5mol/L，提取時間1.5h，料液比1∶25，提取溫度25℃下，黑色素粗提物的得率為12.37%（RSD 2.14%）；純化的黑色素呈黑色、有金屬光澤，得率為2.07%（RSD 9.27%）；粗提物總酚含量以沒食子酸計為0.48%。葵花籽殼黑色素亞硫酸鈉溶液在292nm波長有最大吸收峰，且吸光度與黑色素的濃度呈正相關，紅外光譜圖有黑色素紅外吸收特征。黑色素的還原力和清除DPPH·自由基的能力明顯比VC低，在同一濃度下，純化前后黑色素的抗氧化性能力無明顯改變。

葵花籽殼黑色素，提取，總酚，還原力，DPPH·

葵花，又名向日葵，為菊科植物，我國各地均有栽培，資源十分豐富?？ㄗ褮な窃S多糧油廠、食品廠的廢棄物。葵花籽殼色素含量較高，提取工藝簡單，提取劑可以反復使用。在已開發(fā)的天然色素中，紅色[1]、黃色、綠色等品種較多，藍色則較少，黑色則極為稀缺。葵花籽殼黑色素作為一種天然黑色素，目前的研究較少[2-3]。本文對葵花籽殼黑色素的提取工藝以及其抗氧化能力進行了系統(tǒng)的研究，對葵花籽殼黑色素的利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葵花籽殼 甘肅敬業(yè)農(nóng)業(yè)科技有限公司提供；沒食子酸（gallic acid）、DPPH·（二苯代苦味酰基自由基） SIGMA-ALDRICH.Inc；維生素C 天津市醫(yī)藥工業(yè)技術研究所；乙酸 天津市福晨化學試劑廠；鎢酸鈉 天津市化學試劑四廠；磷酸 天津市化學試劑一廠；鹽酸 滎陽市黃河化工試劑廠；硫酸鋰 天津市密歐化學試劑開發(fā)中心；鐵氰化鉀 國藥集團化學試劑有限公司；亞硫酸鈉、無水碳酸鈉 西安化學試劑廠；氫氧化鈉 天津市恒興化學試劑制造有限公司；大孔樹脂（AB-8） 南開大學化工廠；以上試劑均為分析純；鉬酸鈉 廣東泰山化工廠，化學純；FCR試劑 自制。

Cary 50紫外可見分光光度計 美國瓦里安公司；FT-IR8400s紅外光譜儀 日本島津公司；RE52-86A旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；DEF-6020真空干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；FD-1-SSA冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器公司；JY99-2D超聲波細胞破碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；ZF-7三用紫外分析儀 金壇市盛藍儀器制造有限公司；TG16-WS臺式高速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葵花籽殼黑色素的提取 參照文獻[4-5]，采用堿提酸沉提取。葵花籽皮的黑色素屬于鄰苯二酚型黑色素，易溶于堿溶液，不溶于水和常見的有機溶劑，因此采用堿溶液提取黑色素，再用酸溶液中和，使黑色素沉淀析出。

采用單因素和正交實驗，用FCR試劑總酚測定方法（1.2.4），在765nm波長處測定溶液的吸光值，以確定黑色素提取的最佳條件[6-7]。

根據(jù)預實驗，確定提取溶劑的濃度、料液比、提取時間和提取溫度，是葵花籽皮中黑色素提取效果的關鍵因素。

提取溶劑的濃度：以0.25～2.0mol/L NaOH水溶液為提取溶劑，料液比為1∶15，在25℃下提取1h。

提取時間：以0.5mol/L NaOH水溶液為提取溶劑，料液比為1∶15，在25℃提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h。

料液比：以0.5mol/L NaOH水溶液為提取溶劑，在25℃提取1.5h，料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30。

提取溫度：以0.5mol/L NaOH水溶液為提取溶劑，提取1.5h，料液比為1∶25，提取溫度分別為25、35、45、55℃。

根據(jù)單因素實驗結果，采用四因素三水平L9（34）正交實驗設計（見表1），確定最佳工藝條件。

稱取3g粉碎的原料，在超聲功率為100W的條件下，用一定體積、一定濃度的氫氧化鈉溶液溶解，在一定溫度、一定時間條件下，超聲提取，離心，取上清液，加入等體積的2mol/L鹽酸，靜置，離心，取沉淀用1mol/L氫氧化鈉溶解，同等體積的2mol/L鹽酸沉淀，反復此操作3次，最后得黑色素沉淀。所得沉淀用30mL濃度為0.1mol/L氫氧化鈉溶液溶解，定容到250mL，混合均勻，待測總酚含量。

表1葵花黑色素提取的L9（34）正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test of sunflower melanin extraction L9（34）

1.2.2 葵花籽殼黑色素的提取純化 取一定量經(jīng)干燥、粉碎的葵花籽殼，采用通過正交實驗所得的最佳提取工藝條件，進行超聲波堿提酸沉提取，沉淀物進行冷凍干燥，即得葵花籽殼黑色素粗提物。

粗提物經(jīng)過AB-8大孔樹脂進行純化，用60%乙醇洗脫，收集峰值處洗脫物，濃縮后冷凍干燥得純化的葵花籽殼黑色素。

1.2.3 葵花籽殼黑色素的鑒定 取少量上述黑色素溶解于0.003mol/L亞硫酸鈉水溶液中，并用同樣的亞硫酸鈉水溶液做對照[5]，在Cary 50紫外可見分光光度計下，于200～800nm范圍內(nèi)進行全波長掃描。少量干燥后的上述葵花籽殼黑色素固體用溴化鉀壓片后做紅外光譜掃描。

1.2.4 葵花籽殼黑色素中總酚含量的測定 精確稱取沒食子酸標準品25mg，用水溶解并定容到250mL，得0.1mg/mL的對照品標準溶液。分別準確量取標準液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL于10mL容量瓶中，各加6mL水，搖勻，再加0.5mL FCR試劑，搖勻。1min之后，加入20%碳酸鈉溶液1.5mL，混勻定容。在室溫下反應2h，于765nm波長下比色，測定吸光度，建立標準曲線[6]。黑色素總酚含量測定方法同標準曲線繪制方法。

1.2.5 葵花籽殼黑色素還原力的測定 取不同濃度的樣液2.5mL，加入0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=6.6）和1%K3Fe（CN）6各2.5mL，混合均勻后于50℃水浴反應20min，急速冷卻，取出后加入2.5mL 10%乙酸混勻，而后于3500r/min離心10min。取上清液5.0mL加入蒸餾水5.0mL，0.1%FeCl31.0mL，于700nm處測定吸光值，吸光值越大，則還原力越強[7]。

1.2.6 葵花籽殼黑色素對二苯代苦味?；杂苫―PPH·）清除能力的測定 分別取2.5mL濃度為0.18×10-3、0.42×10-3、0.60×10-3、1.20×10-3、1.8×10-3、3.0×10-3mg/mL葵花籽殼黑色素粗提物溶液與純化黑色素溶液，再分別加入2.5mL濃度為0.025mg/mL的DPPH·乙醇溶液并立即混勻，在室溫下遮光反應30min，用Cary 50紫外可見分光光度計于516nm處在一定時間間隔內(nèi)測定吸光度，以維生素C、沒食子酸作為對照[8-9]。以試樣中濃度對DPPH·的清除率進行作圖，得到SR為50%的所需要樣品的濃度，即得IC50。

式中，Ai——為樣液與DPPH·乙醇溶液混合后在波長516nm處的吸光度值；Aj——為樣液與蒸餾水混合后在波長516nm處的吸光值；A0——DPPH·乙醇溶液與蒸餾水混合后在波長516nm處的吸光度值。

2 結果與分析

2.1 葵花籽殼黑色素的提取條件優(yōu)化

2.1.1 葵花籽殼黑色素提取單因素實驗 葵花籽殼黑色素提取單因素實驗結果見圖1～圖4。

圖1 氫氧化鈉濃度對葵花黑色素提取的影響Fig.1 Effect of concentration of the sodium hydroxide on the extraction of sunflower melanin

圖2 提取時間對葵花黑色素提取的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction of sunflower melanin

圖3 料液比對葵花黑色素提取的影響Fig.3 Effect of the solid-liquid ratio on the extraction of sunflower melanin

圖4 提取溫度對葵花黑色素提取的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction of sunflower melanin

由圖1以看出，溶液吸光度隨著氫氧化鈉濃度的增大而減小，當氫氧化鈉濃度為0.5mol/L時，溶液吸光度最大，NaOH濃度過高會導致色素分解，降低得率。因此，選取氫氧化鈉濃度為0.5mol/L。

由圖2可以看出，溶液吸光度隨著提取時間的增大而增大，但是到一定時間后，提取溶液中的多酚可能受溫度的影響而減少，也可能時間過長導致色素降解，在時間1.5h，溶液的吸光度達到最大值，因此確定提取時間為1.5h。

由圖3可以看出，溶液吸光度隨著料液比的增大而增大，但是到一定范圍后，吸光值下降，在料液比1∶25時達到最大值，因此確定料液比為1∶25。

由圖4可以看出，溶液吸光度隨著提取溫度的增大，先增加后減小，提取溫度為25℃時，吸光度最高。在實驗溫度范圍內(nèi)，25℃為較佳提取溫度。

以總酚測定吸光度為指標，葵花籽殼黑色素提取單因素實驗結果表明，當氫氧化鈉濃度為0.5mol/L、提取時間為1.5h、料液比為1∶25、提取溫度為25℃時，黑色素的提取效果最好。

2.1.2 最佳提取條件的正交實驗 根據(jù)單因素實驗的最佳結果分別設計正交實驗，正交實驗結果見表2。

表2葵花黑色素提取的L9（34）正交實驗結果Table 2 The results of orthogonal test of sunflower melanin extraction L9（34）

由表2中極差R可以看出，RA＞RC＞RB＞RD，即影響因素的影響程度由高到低分別為：氫氧化鈉濃度＞料液比＞提取時間＞提取溫度；最優(yōu)組合為A2B2C2D2，即葵花籽殼黑色素提取最佳工藝條件為：氫氧化鈉濃度0.5mol/L，提取時間1.5h，料液比1∶25，提取溫度25℃。方差分析結果表明，各因素及水平間無顯著差異。

在最佳提取工藝條件下，提取葵花籽殼黑色素，2次重復黑色素粗品得率為12.37%，RSD 2.14%。

2.2 葵花籽殼黑色素的純化

黑色素在堿性溶液中溶解，在酸性溶液中形成沉淀，且在酸性條件下的水解作用可以去除與黑色素結合的蛋白質、碳水化合物以及脂類物質[10]。利用易溶于堿不溶于酸的性質對葵花籽殼黑色素粗品進行多次溶解沉淀洗滌，以除去葵花籽殼黑色素粗提物中的雜質，所得產(chǎn)物為葵花籽殼黑色素粗提物，呈黑色，無光澤。粗提物再經(jīng)過大孔樹脂處理純化，凍干后得純化的黑色素，呈黑色，帶金屬光澤，得率為2.07%（以葵花籽殼計），2次重復，RSD 9.27%。

2.3 葵花籽殼黑色素的鑒定

采用Cary50紫外可見分光光度計全波長掃描，未經(jīng)處理的葵花籽殼黑色素溶液干擾峰較多（圖5a），不便于測定，而和色素亞硫酸溶液在292nm處有最大吸收峰，并隨波長增加，其吸光值下降（圖5b）?？ㄗ褮ず谏丶t外光譜圖（圖6）具有經(jīng)典的黑色素紅外吸收特征，即在3416.43、1647.42cm-1處各有一個吸收峰，在3416.43cm-1附近有一強而寬的單吸收峰，是由O—H的伸縮振動（3450cm-1）產(chǎn)生的，1647.42、1565.79cm-1吸收峰是由芳環(huán)骨架振動產(chǎn)生的，1162.25、1117.41cm-1處是C-O鍵的特征峰，另外在1440.55cm-1附近有烷烴的C-H變形振動吸收。這與王巖等[11]報道的葵花籽殼黑色素可能是鄰苯二酚型的結果一致。

圖5 葵花籽殼黑色素全波長掃描圖譜Fig.5 Full wavelength scanning spectra of sunflower seed shells melanin

圖6 葵花籽殼黑色素紅外光譜圖Fig.6 IR spectrum of sunflower seed shells melanin

2.4 葵花籽殼黑色素中總酚含量

以沒食子酸作為標準品，測定葵花籽殼黑色素總酚含量。沒食子酸在濃度1～9μg/mL內(nèi)與其吸光值呈線性關系，其線性回歸方程為Y=0.093x-0.0062，R2=0.9995，得黑色素粗品中的總酚含量為4.67mg/mL，即葵花籽殼中總酚含量以沒食子酸計為0.48%。

2.5 葵花籽殼黑色素的還原力

還原力是潛在抗氧化性能的重要體現(xiàn)。還原力實驗結果如圖7所示，在同一濃度下，各樣品間存在顯著性差異，葵花籽殼黑色素的還原力明顯低于VC，即在相同濃度下黑色素的還原力低于抗壞血酸，純化后的黑色素還原力略大于黑色素粗品，但沒有顯著提高，即黑色素純化前后的還原力雖有變化，但沒有明顯的改善。

圖7 葵花籽殼黑色素與VC還原力Fig.7 Reducing power of melanin of sunflower seed shells and VC

2.6 葵花籽殼黑色素對DPPH·清除能力的測定

清除自由基的機制在于抗氧化劑抑制脂質過氧化。DPPH·是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，若受試物能將其清除，則表明受試物具有降低羥基自由基、烷基自由基或過氧化自由基和打斷脂質過氧化鏈式反應的作用。通過IC50值比較各物質清除DPPH·自由基的能力，若所需要的IC50濃度越小，表明其清除率越大，抗氧化能力越強。由圖8可以看出，VC、純化黑色素、黑色素粗品、沒食子酸清除DPPH·自由基50%所需要的濃度依次為0.682、0.956、2.26、4.15mg/L，因此它們對DPPH·自由基清除能力大小為：VC＞純化后黑色素＞黑色素粗品＞沒食子酸，純化后黑色素清除自由基的能力略有提高。

圖8 葵花籽殼黑色素及不同抗氧化劑清除DPPH·自由基的IC50Fig.8 IC50value of DPPH radical scavenging activity of the melanin from sunflower seed shell

3 結論

3.1 利用黑色素易溶于堿不溶于酸的性質，在最優(yōu)提取條件：氫氧化鈉濃度0.5mol/L，提取時間1.5h，料液比1∶25，提取溫度25℃下，葵花黑色素粗品的得率為12.37%，RSD 2.14%，純化黑色素得率為2.07%，RSD 9.27%，說明以葵花籽殼為原料提取黑色素有較高的得率。

3.2 葵花籽殼黑色素具有清除DPPH·自由基的能力，純化后黑色素的抗氧化能力強于沒食子酸和黑色素粗品，它們的抗氧化性能的強弱順序為VC＞純化后黑色素＞黑色素粗品＞沒食子酸。

3.3 葵花籽殼黑色素亞硫酸鈉溶液的最大吸收波長為292nm，紅外光譜掃描確定其屬于鄰苯二酚型結構。但由于紫外和紅外光譜法在研究生物大分子結構中的局限性，有關葵花籽殼黑色素分子結構尚需要結合其他分析手段來進一步確證?？ㄗ褮ず谏乜勺鳛槭称泛突瘖y品的天然著色劑，具有很高的開發(fā)價值和應用前景，有望成為一種新型的天然植物黑色素。

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Study on extraction，identification and antioxidant activity of melanin of sunflower seed shell

ZHAO Ping1，WANG Ya1，WEI Ming-guang2，GUO Tao1，ZHANG Yi1，QI Wen-jing1，
CHAI Yuan-qin1，LIN Ying-ji1
（1.School of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China；2.Gansu Jingye Agricultural Science&Technology Co.，Ltd.，Wuwei 733300，China）

The melanin of sunflower seed shell（MS） was extracted based on its characteristics of dissolving in alkaline solution and precipitating in acid solution assisted with ultrasonic.Folin-Ciocalteu（FC） method was used to determine total phenol content，single factor and orthogonal tests were used to determine the optimum extract conditions of MS，UV and infrared spectroscopies were used to identify the structure，the reducing power and ability of scavenging DPPH·were used to evaluate the antioxidant activity against the same concentration of VCand gallic acid.The results showed that optimum extract conditions were 0.5mol/L NaOH，time for 1.5h.，solid-liquid ratio of 1∶25 at 25℃，the crude extract of MS extracted by alkaline and acid was black and lacklustre with a yield of 12.37%，RSD 2.14%，and the purified MS was metallic luster with a yield of 2.07%，RSD 9.27%.The total polyphenol content of crude extract of MS was 0.48%calculated as GAE.The wavelength of maximum absorption peak was 292nm in the solution of sodium sulfite scanned by Cary 50 UVVis spectrophotometer，and absorbance and the concentration of melanin was positively correlated at 292nm.The patterns of classic characteristic absorption of melanin were shown in the ultraviolet and infrared spectrogram，respectively.With the same concentration，the antioxidant capacity of purified melanin was nearly same as that of the crude extract，lower than VCbut higer than gallic acid.

melanin of sunflower seed shell；extraction；total polyphenol；antioxidant activity；DPPH·

TS229

A

1002-0306（2012）22-0133-05

2011－12－13

趙萍（1964-），女，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)后貯藏、加工理論和新技術。

甘肅省自然科學研究基金計劃（0803RJZA044）。