鄰苯二甲醛熒光衍生化法測(cè)定食用海藻中還原型谷胱甘肽

李鉉軍，韓 玲，朱愛(ài)花，崔勝云

（延邊大學(xué)長(zhǎng)白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林延吉 133002）

鄰苯二甲醛熒光衍生化法測(cè)定食用海藻中還原型谷胱甘肽

李鉉軍，韓 玲，朱愛(ài)花，崔勝云*，?

（延邊大學(xué)長(zhǎng)白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林延吉 133002）

用質(zhì)譜和光譜測(cè)定方法研究了OPA和還原型谷胱甘肽（GSH）熒光衍生化反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)OPA分子苯環(huán)上相鄰醛基的歧化反應(yīng)，使得其與GSH發(fā)生衍生化反應(yīng)時(shí)生成三環(huán)和二環(huán)結(jié)構(gòu)的兩種衍生化產(chǎn)物，其中三環(huán)結(jié)構(gòu)的衍生化產(chǎn)物具有較強(qiáng)的熒光發(fā)射特性。利用OPA熒光衍生化法分別測(cè)定了馬尾藻、鹿角菜、龍須菜中GSH的含量。在含OPA的PBS緩沖溶液、激發(fā)波長(zhǎng)λex=350nm時(shí)，樣品溶液在428nm處發(fā)射靈敏的熒光，檢測(cè)限達(dá)3.6×10-8mol/L。用標(biāo)準(zhǔn)加入法分別測(cè)定樣品中GSH含量分別為：0.0714mg/g（馬尾藻），0.1183mg/g（鹿角菜），0.1970mg/g（龍須菜），方法的回收率達(dá)到99.22%～100.41%。

谷胱甘肽，鄰苯二甲醛，馬尾藻，鹿角菜，龍須菜，熒光發(fā)射

馬尾藻（Sargassum siliquastrum）、鹿角菜（Silvetia siliquosa）、龍須菜（Gracilaria lemaneiformis）是我國(guó)沿海盛產(chǎn)的藥食兩用藻類(lèi)，由于其含有在人體內(nèi)具有重要活性功能的活性成分和味美可口被人們視為健康食品廣泛食用。據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，上述藻類(lèi)提取物中海藻多糖具有抗氧化、抗癌、提高免疫力等活性功能[1-3]。至于其他活性成分測(cè)定，目前報(bào)道的還有蛋白質(zhì)、氨基酸、萜類(lèi)、甾醇類(lèi)、生物堿、維生素、抗生素、環(huán)狀多硫化合物、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、微量元素等[4-5]，但鮮見(jiàn)還原型谷胱甘肽（GSH）含量測(cè)定的報(bào)道。GSH是動(dòng)、植物體內(nèi)廣泛分布的含半胱氨酸殘基的三肽，在生物體內(nèi)參與構(gòu)成重要的抗氧化防御系統(tǒng)，具有細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗氧化、參與氨基酸吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)、基因表達(dá)、抗癌、重金屬解毒等多種生物活性功能[6-10]。由于GSH分子中含氧化性的巰基和可被水解的兩個(gè)肽鍵，故只在特定的細(xì)胞環(huán)境中穩(wěn)定存在。通常分析操作中的樣品破壁提取、分離等前處理過(guò)程，會(huì)帶來(lái)有別于胞內(nèi)的相對(duì)苛刻的化學(xué)環(huán)境，這會(huì)導(dǎo)致肽鍵的水解和巰基的氧化變性，無(wú)法得到GSH的完整的分析信息，這可能是許多生物樣品測(cè)試結(jié)果中盡管有氨基端含量信息，但缺少GSH含量信息的原因。這一信息缺失對(duì)植物生物活性成分定位中GSH的活性地位的評(píng)價(jià)也帶來(lái)困難。本研究利用含OPA衍生化試劑的PBS緩沖液作為提取液，采用細(xì)胞破壁、衍生化為一體的樣品前處理方法來(lái)生成相對(duì)穩(wěn)定的熒光衍生化產(chǎn)物，避開(kāi)導(dǎo)致樣品前處理過(guò)程中GSH的肽鍵斷裂和巰基的氧化變性所致的漏檢或靈敏度降低的化學(xué)環(huán)境，由此靈敏測(cè)定了馬尾藻、鹿角菜和龍須菜中的GSH的含量，同時(shí)對(duì)熒光衍生化反應(yīng)機(jī)理也進(jìn)行了進(jìn)一步的探討。本研究對(duì)上述食用藻類(lèi)中GSH營(yíng)養(yǎng)地位及GSH含量測(cè)定的方法學(xué)研究具有實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬尾藻、鹿角菜、龍須菜 均購(gòu)自山東省青島市；還原型谷胱甘肽 Aldrich公司；鄰苯二甲醛 國(guó)藥化學(xué)試劑公司；實(shí)驗(yàn)用水 三次蒸餾水；其他試劑 均為分析純；

RF-5301PC熒光分光光度儀 日本島津公司；HP1100-1946A液-質(zhì)聯(lián)用儀 美國(guó)惠普公司；UV-8500紫外分光光度儀 天美公司；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器；UP-400S超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)；Mini-10K微型離心機(jī)；AP-220ZN空氣泵；pHS-3C實(shí)驗(yàn)室酸度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 光譜測(cè)定OPA溶液的配制 在容量瓶中用適量甲醇溶解一定量的OPA，然后加入PBS緩沖溶液定容并配制成1×10-2mol/L貯備液，測(cè)定時(shí)用PBS緩沖溶液稀釋即得。

1.2.2 待測(cè)樣品的提取 準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2g在80℃烘箱干燥2h后的藻類(lèi)于50mL錐形瓶中，加入含有一定濃度衍生化試劑（OPA）的0.02mol/L的PBS緩沖溶液20mL作為提取液，超聲破壁40min，抽濾，取清液。取10mL清液，加入2倍體積乙醇，放置30min，以8000r/min離心5min除蛋白，取上清液作為供試品。測(cè)定時(shí)取1mL供試品加入PBS緩沖液定容至10mL進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 質(zhì)譜測(cè)定 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，熒光衍生化反應(yīng)受酸度的影響較大，但在pH=7～8的酸度范圍內(nèi)的PBS緩沖溶液中，OPA和GSH皆生成穩(wěn)定的熒光衍生化產(chǎn)物。為了減小緩沖液鹽對(duì)質(zhì)譜儀的影響，質(zhì)譜測(cè)定溶液是分別稱(chēng)取一定量的OPA于兩個(gè)容量瓶中，用適量甲醇溶解，其中一份加入一定量的GSH，再分別用三次蒸餾水稀釋、定容來(lái)配制pH=7的OPA溶液和OPA和GSH混合溶液。所配制的溶液從HP1100-1946A液-質(zhì)聯(lián)用儀質(zhì)譜端口進(jìn)樣，測(cè)定質(zhì)譜圖。質(zhì)譜條件為：離子源：ESI；碰撞電壓：70eV；干燥氣：氮?dú)?；干燥器流量?L/min；干燥氣溫度：350℃；霧化器壓力：55psi；毛細(xì)管電壓：3500V。

1.2.4 樣品測(cè)定 參照Cohn和Leroy等[11-12]確立的GSH和OPA熒光衍生化法測(cè)定GSH的方法。分別取提取液4mL于6份具塞試管中，其中5份加入PBS緩沖液配制的GSH標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，然后用PBS緩沖液皆定容至5mL。選擇350nm波長(zhǎng)為激發(fā)波長(zhǎng)，記錄428nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度。利用熒光發(fā)射強(qiáng)度與GSH濃度之間的線(xiàn)性關(guān)系，利用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行GSH含量測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理、回歸分析及畫(huà)圖是使用Origin數(shù)理統(tǒng)計(jì)和畫(huà)圖軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 OPA和GSH熒光衍生化反應(yīng)

Leroy等[12]報(bào)道，OPA和GSH在PBS（pH=8.0）緩沖溶液中發(fā)生反應(yīng)生成具有三元環(huán)狀的衍生化產(chǎn)物，該衍生化產(chǎn)物具有較強(qiáng)的熒光發(fā)射能力，借此可用熒光分光光度法靈敏測(cè)定GSH的含量。由于OPA的苯環(huán)鄰位兩個(gè)醛基通常在弱堿性條件下易發(fā)生Canizzaro歧化反應(yīng)，因此溶液的酸度對(duì)衍生化產(chǎn)物的生成可能有影響。為了探討OPA歧化反應(yīng)對(duì)衍生化反應(yīng)的影響，利用電噴霧質(zhì)譜端口分別測(cè)定了OPA和OPA+GSH混合溶液的質(zhì)譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 OPA和GSH混合溶液的質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectra of OPA and GSH mixture solution

如圖1所示，OPA分別在m/z=135.0和m/z=149.1處觀察到OPA的質(zhì)子化的分子離子峰和鄰苯二甲酸酐的質(zhì)子化的分子離子峰。當(dāng)OPA溶液中含有GSH時(shí)，除了m/z=308.1處的GSH的質(zhì)子化的分子離子峰外，分別在m/z=406.1和m/z=424.1處分別出現(xiàn)OPA和GSH相互作用生成的兩種衍生化產(chǎn)物的質(zhì)譜峰。圖1的結(jié)果表明，OPA在中性水溶液中也發(fā)生歧化反應(yīng)生成鄰-羧基-苯甲醇，該歧化產(chǎn)物在電噴霧氣相中脫水縮合生成鄰苯二甲酸酐，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)由于OPA的歧化反應(yīng)導(dǎo)致生成兩種與GSH作用產(chǎn)物。

為了進(jìn)一步探討OPA的歧化作用對(duì)與GSH衍生化反應(yīng)及其光譜特性的影響，在pH=8的PBS緩沖溶液中分別測(cè)定了OPA和OPA+GSH的混合溶液的UV-vis吸收光譜并設(shè)定衍生化產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)作物激發(fā)波長(zhǎng)測(cè)定了熒光發(fā)射光譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖2。

如圖2（A）所示，OPA溶液只出現(xiàn)λmax=258nm處出現(xiàn)苯環(huán)π→π*躍遷的B吸收帶和λmax=300nm處出現(xiàn)羰基n→π*躍遷所致吸收帶。當(dāng)溶液中含GSH時(shí)，分別在λmax=340nm處和λsh=350nm處出現(xiàn)衍生化產(chǎn)物的吸收峰和吸收肩峰。分別選擇該吸收波長(zhǎng)為激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)定OPA+GSH的混合溶液的熒光光譜，見(jiàn)圖2（B），盡管λmax=340nm處比起λsh=350nm具有較強(qiáng)的吸收強(qiáng)度，但所對(duì)應(yīng)的的衍生化產(chǎn)物的熒光發(fā)射強(qiáng)度弱于λsh=350nm所對(duì)應(yīng)的熒光發(fā)射強(qiáng)度，說(shuō)明λsh=350nm具有吸收肩峰的熒光衍生化產(chǎn)物具有較強(qiáng)的熒光發(fā)射能力。根據(jù)圖1～圖2的質(zhì)譜和光譜解析，OPA和GSH的混合溶液中發(fā)生圖3所示衍生化反應(yīng)。

圖2 OPA和GSH混合溶液的UV-vis吸收光譜圖和熒光光譜圖Fig.2 Uv-vis spectra and fluorescent spectra for mixture solutionof OPA and GSH

圖3 OPA和GSH衍生化反應(yīng)Fig.3 Derivatizing reaciont between OPA and GSH

如圖3所示，OPA與GSH衍生化反應(yīng)包括OPA的兩個(gè)醛基和GSH的巰基和胺基的直接縮合反應(yīng)和OPA經(jīng)歧化后通過(guò)苯環(huán)上的羥基和羧基與GSH巰基和胺基的縮合反應(yīng)。直接縮合產(chǎn)物分子具有較高的共軛度和三元環(huán)狀結(jié)構(gòu)的剛性結(jié)構(gòu)、故該衍生化產(chǎn)物的熒光發(fā)射能力比起OPA歧化后的縮合生成的衍生化產(chǎn)物更強(qiáng)。

2.2 GSH含量測(cè)定

圖4分別為含過(guò)量OPA的馬尾藻、鹿角菜、龍須菜提取液及該提取液加GSH標(biāo)準(zhǔn)系列溶液時(shí)的熒光發(fā)射光譜圖。

圖4的結(jié)果表明，在含OPA的提取液在428nm發(fā)出較強(qiáng)的熒光，說(shuō)明樣品提取液中含有GSH，當(dāng)該提取液中加入GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，熒光法射強(qiáng)度隨加入GSH的濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，其回歸方程分別為If=1.52731+2.32532C（馬尾藻），If=2.37603+1.14786C（鹿角菜），If=2.85815+0.83633C（龍須菜），相關(guān)系數(shù)均大于0.99。根據(jù)圖4～圖5的測(cè)定結(jié)果和回歸方程，用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定了馬尾藻、鹿角菜、龍須菜中的GSH含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖4 樣品的熒光光譜圖Fig.4 Fluorescent spectra of the sample

表1 GSH含量測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results for GSH

表1結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定馬尾藻、鹿角菜、龍須菜中的三次測(cè)定GSH的平均值分別為0.0714、0.1183、0.1970mg/g，回收率范圍98.69%～100.41%。檢測(cè)限是參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行了測(cè)定。利用標(biāo)準(zhǔn)GSH溶液測(cè)定了熒光光譜圖，發(fā)現(xiàn)熒光發(fā)射強(qiáng)度在1×10-7～1×10-6mol/L呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，其線(xiàn)性回歸方程為If=0.1542+2.2364CGSH。然后在相同條件下分別平行測(cè)定空白溶液8次，其熒光值（）為0.8985±0.02124。根據(jù)YE=μ+kσ（式中，YE指可被檢出的最小分析信號(hào)，指平均空白信號(hào)值，k為置信度相關(guān)的整數(shù)，這里取k=3，μ代表平均空白信號(hào)值、σ代表標(biāo)準(zhǔn)偏差）則YE=0.8985+3×0.02124，將其代入線(xiàn)性回歸方程換算得檢測(cè)限為3.6×10-8mol/L。

3 結(jié)論

3.1 由于OPA的歧化作用，在pH=7~8的溶液中OPA和GSH相互作用生成兩種衍生化產(chǎn)物。一種是OPA的相鄰醛基與GSH的巰基和胺基縮合生成的三環(huán)共軛結(jié)構(gòu)的衍生化產(chǎn)物，另一種是OPA歧化產(chǎn)物的羧基和羥基與GSH的巰基和胺基縮合生成二環(huán)共軛產(chǎn)物，其中前者具有更強(qiáng)的熒光發(fā)射能力。

3.2 在過(guò)量OPA的PBS緩沖溶液中，OPA和GSH的衍生化產(chǎn)物所發(fā)射的熒光強(qiáng)度與GSH濃度間呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，加標(biāo)回收率也達(dá)到98%以上。因此，在本研究實(shí)驗(yàn)條件下盡管發(fā)生OPA的歧化作用，但仍可準(zhǔn)確測(cè)定GSH的含量。

3.3 馬尾藻、鹿角菜、龍須菜三種可食藻類(lèi)中都含較豐富的GSH，其中龍須菜中GSH的含量最高，達(dá)到0.1970mg/g。

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Determination of glutathione in edible marine algae using OPA fluorescence derivatizing method

LI Xuan-jun，HAN Ling，ZHU Ai-hua，CUI Sheng-Yun*，?
（Key Laboratory of Natural Resources of Changbai Mountain&Functinal Molecules，Ministry of Education Yanbian University，Yanji 133002，China）

The derivatizing reaction between OPA and reduced glutathione（GSH） were investigated using ESIMS，spectrometric analysis.Because of Cannizaro reaction of OPA in the solution，two derivitized products had been formed with conjugated tricyclic structure and bicyclic structure，in which much more fluorescent emmision properties was observed by derivatized product with tricyclic conjugated structure.In PBS buffer soluiton，using OPA as derivatizing agent，GSH content in Sargassum siliquastrum，Silvetia siliquosa，Gracilaria lemaneiformis had been determined by fluorometryic analysis.In OPA+PBS mixture buffer solution with excitation wavelength at 350nm，the sample emmited strong fluorescence at 428nm，the detection limit was 3.6×10-8mol/L.GSH contents determined with standard addition methods in the samples were 0.0714mg/g（Sargassum siliquastrum），0.1183mg/g（Silvetia siliquosa），0.1970mg/g（Gracilaria lemaneiformis） respectively，and the reconveries were in the range of 99.22%～100.41%.

glutathione；OPA；Sargassum siliquastrum；Silvetia siliquosa；Gracilaria lemaneiformis；fluorescence

0652.3

A

1002-0306（2012）22-0081-04

2012－06－12 *通訊聯(lián)系人 ?并列第一作者

李鉉軍（1977-），男，碩士，講師，研究方向：食品分析。

崔勝云（1957-），男，博士，教授，研究方向：生物有機(jī)分析。

國(guó)家自然科學(xué)基金（21165021）。