環(huán)介導恒溫擴增法鑒定牛羊肉中的攙雜肉

侯東軍，楊紅菊，于 雷，李 穎，王 海，姜艷彬

（中國動物疫病預防控制中心，北京 100125）

環(huán)介導恒溫擴增法鑒定牛羊肉中的攙雜肉

侯東軍，楊紅菊，于 雷，李 穎，王 海，姜艷彬*

（中國動物疫病預防控制中心，北京 100125）

建立了一個鑒定牛羊肉中攙雜雜動物肉的環(huán)介導恒溫擴增檢測方法。確定了一套可在牛羊肉中特異并靈敏地檢測出攙雜肉成分的引物對，以動物細胞色素b基因組為模板可在恒溫63℃恒溫特異性擴增出豬等基因片段而無其他擴增片段影響?？蓹z測牛肉中0.01%～2%的豬肉成分。經與PCR方法比對，結果表明，該方法可有效用于實際生鮮肉或加工肉制品樣本的鑒定。

環(huán)介導恒溫擴增，真實性，鑒定

在國內及國際貿易中牛、羊肉中攙雜價格便宜的豬肉，以次充好的欺騙行為屢見不鮮，在清真肉品種摻豬肉以代替牛羊肉更是嚴重冒犯了廣大具有伊斯蘭教信仰的消費者，影響民族團結，這些摻假行為極大損害了消費者的利益。20世紀80年代，國外開始對肉的種屬鑒定進行研究，采用的方法主要有DNA雜交、免疫擴散和等電點聚焦等。這些方法大都存在著成本高，工作量大，檢測對象要求高等缺點[1-2]。目前，針對摻假行為的檢測研究主要基于核酸擴增的PCR方法，檢測速度快，靈敏和特異性強，但需要PCR儀才能擴增，這就限制了該技術在條件有限的實驗室的應用和推廣[3-4]。環(huán)介導恒溫擴增技術是一種相對于PCR技術較新的核酸擴增技術，特異性、靈敏度都較高，同時可進行恒溫擴增反應，對設備要求低，有時僅用恒溫水浴鍋就可以完成檢測。線粒體中細胞色素b基因高度保守，被廣泛應用于動物成分鑒別的引物設計，本研究根據豬、牛等動物細胞色素b的DNA序列設計并最后確定了引物，建立了環(huán)介導恒溫擴增方法鑒定牛羊肉中攙雜肉的方法，探索了該方法在摻假鑒別行為中的可能性。研究中采用了市場上新出現的等溫擴增熒光檢測系統(tǒng)，便于更直觀的反應擴增反應情況，該系統(tǒng)利用熒光染料不同于另外的濁度法恒溫擴增系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬肉、牛肉、雞肉、鯉魚等動物肉樣品 購自北京市各大型超市；蛋白酶K、RNA酶、dNTP、10×PCR緩沖液（含Mg2+）、TaqDNA聚合酶、50bp ladder DNA marker等 均購自北京天根生化科技有限公司；Lamp恒溫擴增DNA試劑盒、Lamp恒溫擴增熒光檢測試劑盒 日本榮研；等溫擴增mastermix 英國OPTIGENE。

PCR擴增儀、凝膠成像儀、電泳系統(tǒng) BIO-RAD；臺式離心機 Sigma；等溫擴增熒光檢測系統(tǒng) 英國OPTIGENE。

1.2 LAMP引物的設計與合成

從GenBank中下載豬、牛、羊、雞、魚的細胞色素b DNA序列，然后利用BLAST和CLUSTAL W程序進行序列比對確定特異保守序列，運行引物設計軟件Primer Explorer version 3.0（http：//primer explorer.jp/e/v3_manual/index.htmL）設計引物序列，用高壓滅菌后的超純水溶解，配制成100μmol/L的儲備液。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 DNA模板的提取

總DNA提取步驟如下：1.5mL離心管中加入約50mg樣品，加200μL TE溶（pH8.0），旋渦混勻，加入400μL裂解液，旋渦混勻；加600μL酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），劇烈振蕩，12000×g離心10min；取上清液，加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1），劇烈振蕩，12000×g離心10min；取上清液，加入等體積氯仿，劇烈振蕩，12000×g離心10min；取上清液，加0.8倍體積異丙醇，12000×g離心10min；取沉淀，70%乙醇清洗1次，室溫或50℃，20min晾干；加80μL TE（pH8.0）溶解。也可用等效動物基因組提取試劑盒提取基因組DNA。

1.4 Lamp反應

配制25μL Lamp反應體系，其中各成分含量為：反應緩沖液15μL，引物4μL（40pmoL引物FIP，40pmoL引物BIP，5pmoL引物B3，5pmoL引物F3），5μL動物基因組DNA，1μL無菌超純水，1μL Bst聚合酶，1μL熒光試劑，混勻快速離心，63℃恒溫擴增50min。用等溫擴增熒光檢測系統(tǒng)觀察反應并記錄結果。

1.5 特異性實驗

分別提取豬肉、雞肉、鯉魚肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉中總DNA后，用所設計引物對上述各種DNA成分分別進行Lamp反應，比較引物特異性，從而選擇特異性引物。

1.6 靈敏度實驗

用研缽研磨制備豬肉、牛肉摻雜樣本，分別制備2%、0.5%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%的豬肉的牛肉粉，按照上述方法提取DNA后進行Lamp反應并檢測。

1.7 實際樣品檢測

對從北京各大超市購買銷售量較大的加工肉制品分別提取DNA進行Lamp反應，同時與PCR方法[5-6]進行比對。

2 結果與分析

2.1 特異性實驗

用所設計引物對豬肉、雞肉、鯉魚肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉DNA成分分別進行Lamp反應，比較引物特異性，從而確定一套特異性引物，引物信息見表1。用該引物對這幾種動物成分進行Lamp反應，熔解曲線見圖1，該引物對雞肉、鯉魚肉和豬肉成分均可產生熔解曲線，可擴增出雞肉、鯉魚肉和豬肉成分，不能擴增牛肉成分、綿羊成分和山羊成分，說明該引物可用于牛、羊肉中雞肉、鯉魚肉和豬肉成分的摻雜鑒定。

圖1 引物特異性熔解曲線Fig.1 Primer specificity melted curve

2.2 靈敏度實驗

分別提取含有2%、0.5%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%的豬肉粉的牛肉粉中動物基因組DNA，然后分別進行擴增，Lamp擴增曲線如圖2所示，可見隨著濃度的降低該擴增曲線同DNA濃度梯度成一定的線性關系，但是隨著豬肉成分含量的降低，擴增時間也逐漸增長，當牛肉粉中豬肉粉含量降至0.05%時，擴增時間增長至40min，0.01%時，也有明顯的擴增曲線。G1樣本無相應擴增曲線，經查實是由于實驗失誤未加入相應DNA而未發(fā)生擴增。

圖2 不同濃度豬肉成分擴增曲線Fig.2 Amplification curve of different pork content

2.3 實際樣本鑒定結果

從超市購買銷售比例較大并標明肉類成分的幾種肉制品用上述方法提取DNA并進行檢測，每個樣品都做了一個平行樣，并同時用PCR方法進行比對，8個樣本的檢測結果兩種方法一致率100%。結果表明該方法可以用于肉及肉制品中雞肉、魚肉、豬肉的摻假鑒別。注：“C+”表示擴增出雞肉成分；“P+”表示擴增出豬肉成分；“F+”表示擴增出魚成分；“-”表示未擴增出目標條帶；“+”表示有陽性擴增。

表2 市場樣本檢測比對Table 2 Detection of samples from market by Lamp and PCR

3 討論

環(huán)介導恒溫擴增技術是一種近年來被廣泛應用于鑒定病原菌、病毒、寄生蟲、真菌以及轉基因生物等，與核酸擴增有關的恒溫擴增技術。該技術使用4～6個引物，可針對靶標基因的6個不同的區(qū)域。擴增溫度可選擇60～65℃范圍內的某個適宜溫度進行恒溫擴增，因此，可利用恒溫水浴鍋進行檢測反應，是一種可應用于檢測條件有限的國家或區(qū)域的技術平臺。另外，該技術相對于PCR技術反應速度更快，靈敏度和特異性都很好[7-9]。肉及肉制品的真實性鑒別可通過基于核酸擴增的PCR技術進行鑒別，因此應該也可以利用環(huán)介導恒溫擴增技術進行鑒別。本研究針對幾種主要肉成分的細胞色素b基因設計了環(huán)介導恒溫擴增引物，結果發(fā)現該反應不擴增?；蜓虺煞?，可擴增豬、雞、魚成分，因此可用于鑒別?；蜓虺煞种胸i、雞、魚成分的摻假鑒別。熔解曲線中溫度小數點后的誤差是由于測量導致。本方法可檢測牛肉粉中最低0.01%的豬肉粉，說明其靈敏度可滿足實際需要。研究中選用了一種含有某種特定熒光染料的環(huán)介導恒溫擴增試劑盒，并且所利用的便攜式等溫擴增儀器具有熔解曲線功能和擴增曲線功能，分別用于鑒別引物的特異性和靶基因的擴增情況，便于觀察反應規(guī)律和分析。日本榮研公司生產的恒溫擴增DNA試劑盒基于濁度法原理，可通過在Lamp反應中添加鈣黃綠素染料達到在紫外燈下直接觀察反應結果的目的，按照該試劑盒的使用說明，我們使用本方法中引物對在恒溫水浴63℃下反應50min，在紫外燈下可觀察到反應結果。目前，應用環(huán)介導恒溫擴增技術進行肉的真實性鑒別除Minhaz Uddin Ahmed等[10]有用該技術結合電化學DNA傳感器進行肉的鑒別外，沒有其他的報道。本研究目前僅對實驗室易獲取的雞、豬肉等幾種動物成分進行了測試研究，下一步準備擴大樣本范圍，進一步研究該方法的適用范圍。

[1]Andrews C D，Berger R G，Mageau R P，et al.Detection of the beef，sheep，deer and horse meat in cooked meat products by enzyme-linked immunosorbentassay[J].JournalofAOAC International，1992，75：572-576.

[2]Cota-Rivas M，Vallejo-Cordoba B V.Capillary electrophoresis for meat species differentiation[J].Journal of Capillary Electrophoresis，1997，4（4）：195-199.

[3]Kesmen Z，Sahin F，Yetim H.PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages[J].Meat Science，2007，77（4）：649-653.

[4]Zhang C L，Mark R F，Nigel W S，et al.A TaqMan real-time PCR system for the identification and quantification of bovine DNA in meats，milks and cheeses[J].Food Control，2007，18（9）：1149-1158.

[5]Benedetto A，Abete M C，Squadrone S.Towards a quantitative application of real-time PCR technique for fish DNA detection in feedstuffs[J].Food Chemistry，2011，126（3）：1436-1442.

[6]Luo J Q，Wang J Q，Bu D P，et al.Development and Application of a PCR Approach for Detection of Bovis，Sheep，Pig，and Chicken Derived Materials in Feedstuff[J].Agricultural Sciences in China，2008，7（10）：1260-1266.

[7]Nagamine K，Hase T，Notomi T.Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers[J].Mol Cell Probes，2002，16（3）：223-229.

[8]Nagamine K，Watanabe K，Ohtsuka K，et al.Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template[J].Clin Chem，2001，47：1742-1743.

[9]Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res，2000，28（12）：E63.

[10]Ahmed M U，Hasan Q，Mosharraf Hossain M，et al.Meat species identification based on the loopmediatedisothermalamplification and electrochemical DNA sensor[J].Food Control，2010，5（21）：593-790.

Meat species authenticity identification by
loop-mediated isothermal amplification assay in beef and mutton

HOU Dong-jun，YANG Hong-ju，YU Lei，LI Ying，WANG Hai，JIANG Yan-bin*
（China Animal Disease Control Center，Beijing 100125，China）

A loop-mediated isothermal amplification（Lamp） method was developed for meat ingredients authenticity identification in beef and mutton.A set of universal primer used for Lamp at 63℃was chosen to differentiate animal gene encoding cytochrome b with high sensitivity.0.01%～2%pork could be detected in beef and mutton by the method.Besides，the method could be used to detect animal meats processed or unprocessed.

LAMP；authenticity；detection

TS207.3

A

1002-0306（2012）22-0060-03

2012－06－12 * 通訊聯系人

侯東軍（1975-），男，碩士，研究方向：動物產品質量安全。